青霉来源葡萄糖脱氢酶的克隆、表达及其酶学性质研究

论文摘要

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶（FAD-dependent glucose dehydrogenase，简称FADGDH，EC1.1.99.10）能够在NAD（P）+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和NAD（P）H。由于其具有对热稳定、高转换数和高底物特异性等优良酶学性质，在生物燃料电池、酶生物传感器和辅酶再生系统等领域有极大应用价值。FAD依赖的葡萄糖脱氢酶的研究具有非常重要的理论价值和应用价值。本研究从沼气池淤泥中筛选得到一株产FADGDH的菌株ZG1，通过形态观察和18S rDNA鉴定，该菌株属于青霉属（Penicillium sp.）。根据FADGDH蛋白质比对结果寻找保守区并设计简并引物，利用touch-down PCR获得保守区核酸序列。然后利用TAIL-PCR获得两翼的序列。经BLAST与GenBank中已发表的GDH氨基酸序列进行比对，最高相似性为61%，基因命名为gdhz1。提取菌株ZG1的总RNA并经逆转录获得基因的cDNA序列。该基因全长1923bp，其中有2个内含子，cDNA序列1776bp，编码591个氨基酸和一个终止密码子，其中前18个氨基酸为信号肽序列。GDHZ1包含有5个潜在的糖基化位点：68NVS、254NTS、326NIS、378NSS和507NAS。将不含有信号肽的基因序列命名为gdhns（no signal）。gdhns分别连接pET30a（+）和pPIC9载体，并分别在大肠杆菌BL21（DE3）和毕赤酵母GS115中重组表达。在大肠杆菌BL21中表达的绝大部分蛋白质为包涵体，利用4mol/l尿素变性缓冲液溶解结合稀释复性可获得最高的复性率。使用Ni2+亲和层析柱对复性蛋白质进行了纯化和酶学性质分析。gdhns基因在毕赤酵母中也成功地实现了异源分泌表达，但是表达量仅为0.1U/ml。对纯化后的重组酶蛋白GDHZ1进行了酶学性质测定，结果表明，GDHZ1的最适温度为40℃，最适pH为6.5。该酶具有较好的pH稳定性，在pH4–7范围内相对酶活力超过80%。在40℃下处理150min，酶活性基本不改变，在50℃下处理30min仍有50%的活性，说明该酶具有一定的热耐受性。离子Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+和化学试剂SDS对酶活有较大影响，在10mmol/l终浓度下仅保留大约40%的活性，特别是在10mM Ni2+的存在下，剩余酶活不到20%。GDHZ1以葡萄糖为最适底物，其中对半乳糖有40%的相对活力（以葡萄糖的活力计为100%）。在以葡萄糖为底物在最适反应条件下测到GDHZ1动力学参数Km为5.446mmol/l，Vmax为0.1151mmol/l/min，Kcat为29.7s-1，Kcat/Km为5.45l/mmol/s。比活为94.14U/mg。GDHZ1较好的稳定性、离子化学试剂耐受性、高底物特异性和较好的动力学使得该酶在辅酶再生、生物燃料电池和生物传感器（特别是血糖监测）等领域具有很广阔的前景。在国内首次成功在大肠杆菌和毕赤酵母中表达FAD依赖葡萄糖脱氢酶基因。并对FAD依赖葡萄糖脱氢酶的酶学性质进行了测定。为葡萄糖脱氢酶的开发应用奠定了理论和技术基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶简介
• 1.1.1 葡萄糖脱氢酶的分类及来源
• 1.1.2 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶发展历程
• 1.1.3 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶的生理功能
• 1.2 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶的应用
• 1.2.1 生物燃料电池
• 1.2.2 酶生物传感器
• 1.2.3 辅酶的再生
• 1.3 依赖 FAD 的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖氧化酶异同点
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 产 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶菌株的筛选和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 土样、菌株和质粒
• 2.1.2 培养基及主要溶液的配制
• 2.1.3 引物合成
• 2.1.4 工具酶、试剂盒和生化试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 产 FADGDH 菌株的筛选
• 2.2.2 丝状真菌基因组 DNA 的提取
• 2.2.3 大肠杆菌 JM109 热激感受态的制备
• 2.2.4 真菌菌株种属鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 产 FADGDH 阳性菌株筛选
• 2.3.2 菌株鉴定
• 2.4 讨论
• 本章小结
• 第三章 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶基因的克隆
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基及主要溶液的配制
• 3.1.3 引物合成
• 3.1.4 工具酶、试剂盒和生化试剂
• 3.1.5 主要仪器
• 3.1.6 本章所用引物序列
• 3.1.7 本章所构建的主要载体
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶基因克隆简并引物的设计
• 3.2.2 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶保守区核酸序列的克隆
• 3.2.3 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶全长序列的克隆
• 3.2.4 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶完整基因 cDNA 序列的克隆
• 3.2.5 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶 cDNA 序列分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的比对及保守区简并引物的设计
• 3.3.2 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶序列的克隆
• 3.3.3 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶 cDNA 序列 gdhz1 的克隆
• 3.3.4 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶基因 gdhz1 序列分析和相似性比较
• 3.4 讨论
• 本章小结
• 第四章 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶的表达及性质分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 培养基及主要溶液的配制
• 4.1.3 引物合成
• 4.1.4 工具酶、试剂盒和生化试剂
• 4.1.5 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 去除信号肽基因的获得
• 4.2.2 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶酶活测定方法
• 4.2.3 表达载体的构建
• 4.2.4 重组表达大肠杆菌的转化和诱导表达
• 4.2.5 包涵体的变性和复性
• 4.2.6 毕赤酵母重组子的构建
• 4.2.7 毕赤酵母重组子的筛选
• 4.2.8 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶酶学性质分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 去除信号肽基因的获得
• 4.3.2 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶测定酶活标准曲线
• 4.3.3 重组表达载体的构建
• 4.3.4 原核表达系统中目的蛋白的诱导表达
• 4.3.5 包涵体的变性和复性
• 4.3.6 gdhns 基因在毕赤酵母中的表达
• 4.3.7 FAD 依赖葡萄糖脱氢酶的酶学性质
• 4.4 讨论
• 本章小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历