膜荚黄芪cDNA文库构建与异黄酮合成酶基因的克隆

论文摘要

膜荚黄芪为长白山区濒危的野生药用植物之一,是珍贵的中药材资源,其次生代谢产物具有多种生理功能,具有重要的药用价值。但是膜荚黄芪功能基因和次生代谢生物合成途径的研究相对较少。因此,保存膜荚黄芪基因资源和加速基因水平的研究进程具有重要意义。本文构建了野生膜荚黄芪根的cDNA文库,通过cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法克隆了异黄酮合成酶（IFS）基因的全长序列,分析了IFS基因在膜荚黄芪叶片和不定根中的表达情况,并第一次尝试将IFS基因转入生菜。应用SMART技术成功构建了膜荚黄芪根cDNA文库。经文库质量鉴定表明：原始文库滴度为4.6×105 cfu/mL,重组率接近100%,插入片段大小范围在0.5-2kb之间。利用RACE技术从膜荚黄芪中克隆了异黄酮合成中起关键作用的IFS基因全长cDNA序列,命名为AmIFS（登录号：JN882009）。AmIFS cDNA全长1903 bp,包括1578 bp的ORF,116 bp的5’非转译区（5’UTR）,209 bp的3’非转译区（3’UTR）和13 bp的polyA尾,推测其编码525个氨基酸。通过半定量实验表明,在膜荚黄芪生长发育过程的5个时期中,IFS基因在花期（6月）表达量最低,在10月份表达量最高；IFS基因在不定根生长过程中持续表达,预示不定根能够生物合成黄芪异黄酮。转IFS基因生菜实验,初步确定了外源的膜荚黄芪IFS基因已经整合进生菜基因组。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 试验试剂
• 1.1.2 培养基与缓冲液
• 1.2 cDNA文库构建
• 1.2.1 膜荚黄芪总RNA的提取
• 1.2.2 cDNA第一链合成
• 1.2.3 Primer Extension合成ds cDNA
• 1.2.4 ds cDNA的纯化和大小片段的分级分离
• 1.2.5 cDNA与pSMART2IF载体连接
• 1.2.6 制备电击感受态细胞DH5α
• 1.2.7 连接产物的转化
• 1.2.8 初始文库滴度测定
• 1.2.9 文库插入片段长度检测与重组率检测
• 1.3 异黄酮合成酶（IFS）基因克隆
• 1.3.1 膜荚黄芪总RNA的提取
• 1.3.2 IFS基因cDNA末端快速扩增
• 1.3.3 IFS基因编码序列的扩增
• 1.3.4 PCR产物的T载体克隆
• 1.3.5 野生膜荚黄芪不定根的培养
• 1.3.6 IFS基因的表达特性分析
• 1.4 转IFS基因生菜
• 1.4.1 植物材料
• 1.4.2 主要基本培养基
• 1.4.3 IFS基因对生菜的遗传转化及抗性植株的筛选
• 1.4.4 转IFS基因生菜植株的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 野生膜荚黄芪cDNA文库构建
• 2.1.1 cDNA文库构建总RNA的提取
• 2.1.2 野生膜荚黄芪ds cDNA的纯化和分离
• 2.1.3 cDNA文库的质量评价
• 2.2 野生膜荚黄芪IFS基因全长的克隆
• 2.2.1 克隆IFS基因总RNA的提取
• 2.2.2 膜荚黄芪IFS基因3'-RACE
• 2.2.3 膜荚黄芪IFS基因5'-RACE
• 2.2.4 膜荚黄芪IFS基因编码序列的克隆
• 2.3 野生膜荚黄芪IFS基因的生物信息学分析
• 2.3.1 膜荚黄芪IFS基因的全长cDNA序列
• 2.3.2 膜荚黄芪IFS基因的蛋白质序列分析
• 2.4 野生膜荚黄芪IFS基因的表达特性分析
• 2.4.1 野生膜荚黄芪叶片和不定根不同时期RNA的提取
• 2.4.2 不同时期IFS的半定量分析
• 2.5 转IFS基因生菜结果分析
• 2.5.1 植物表达载体的构建和鉴定
• 2.5.2 植物表达载体的农杆菌转化及鉴定
• 2.5.3 生菜的遗传转化
• 2.5.4 转基因生菜植株的PCR鉴定
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢