论文摘要
前言早产儿慢性肺疾病（CLD）是早产儿长时间吸入高浓度氧、机械通气治疗或感染后的最常见并发症。尽管其发生机制尚不清楚,但早期的肺泡上皮损伤及晚期不可逆的肺间质纤维化的病理结局已被公认。近年来,随着极低出生体重儿的存活率明显提高,CLD的发生率也在逐年增加,现已成为威胁早产儿健康和生命的首要疾病。虽然CLD的病因复杂,但长时间吸入高浓度氧气目前被学者们认为是早产儿CLD发生的最主要原因及最危险因素。因此,探索高氧致早产儿CLD肺纤维化的发生机制是国内外研究的焦点问题。早产儿CLD的主要病理变化是肺成纤维细胞增生、细胞外基质的沉积及肺组织的纤维化。目前有关其发病机理的研究多集中在如下几个方面:（1）因早产儿肺组织的抗氧化能力尚不成熟（如超氧化物岐化酶等缺乏）,当长时间吸入高浓度氧后,大量的氧自由基生成,导致氧化应激性肺损伤。（2）细胞因子作用的结果。越来越多的证据表明,CLD的发生与多种细胞因子的协调作用密切相关。其中涉及促炎和促纤维化的细胞因子包括:IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等,这些物质引起炎症反应过程,募集并刺激炎症细胞。另外,IL-4、IL-10、TGF-β1、VEGF等细胞因子发挥抗炎、促纤维化及调节新生血管形成的作用。（3）细胞外基质（ECM）动态平衡的破坏也参与了CLD的发生。基质金属蛋白酶（MMPs）是一个蛋白水解酶家族,主要作用降解细胞外基质,在肺发育过程中起重要作用。胶原酶MMP-1和MMP-8降解Ⅰ型胶原（细胞外基质的主要结构蛋白）,明胶酶MMP-2、MMP-9降解Ⅳ型胶原（肺基底膜的主要成分）。金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）调节了MMPs的活性。若上述MMPs表达水平减少或TIMPs表达增加都可使ECM沉积而发生纤维化。p16基因又称多肿瘤抑制基因,最早是作为一重要的抑癌基因被发现的,直接作用于细胞周期,抑制细胞的增殖,目前被认为是重要的细胞周期调控因子。近年来已经成为生命科学领域的热点研究。在肿瘤的研究中已发现,p16基因启动子区域的甲基化异常对其基因表达有明显的抑制作用,可在转录水平调控基因的表达,从而引起相应表达基因的沉默。大量的研究资料结果表明,因p16基因的启动子甲基化而引发的p16失活与多种恶性肿瘤、肠上皮化生、银屑病、烧伤后瘢痕的形成及衰老的发生等等密切相关。那么在早产儿CLD的发生中,因肺间质成纤维细胞异常增殖而导致的肺纤维化是否与上述疾病有类似的基因调控过程,尚有待于研究和阐明。故本研究将在我们以往研究的基础上,以高氧诱导的早产鼠CLD模型和分离培养的肺间质的成纤维细胞为研究对象,从组织学、细胞和分子的水平,研究p16基因在CLD肺纤维化中作用机制,从新的角度探索早产儿肺纤维化的发生机制,从而为重新设计CLD的有效防治途径寻找新的突破口。实验材料及方法一、动物模型制备本实验在中国医科大学盛京医院实验动物中心完成。实验组将剖宫取出的早产Wistar大鼠（连同母鼠）生后立即置于氧箱中,持续输入氧气,维持FiO2为0.90（用测氧仪监测）,CO2浓度＜0.5%（用钠石灰吸收CO2）,温度25℃～27℃,湿度50%～70%,每24 h定时开箱30 min,添加水、饲料及更换垫料,并与对照组交换母鼠以避免其因氧中毒致喂养能力下降。对照组FiO2为0.21,具体方法及实验控制因素同实验组。二、标本采集和处理每组分别于实验后3,7,14和21d随机选取10只Wistar早产鼠麻醉（5%水合氯醛0.6ml/100mg）后处死,将左肺组织置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,常规制备5μm组织切片。右肺组织置于无Rnase的Eppendorf管中,-80℃冻存,用于其他指标检测。三、肺成纤维细胞的分离、培养及鉴定分别于实验后3,7,14和21d随机选取Wistar早产鼠6只,经5%水合氯醛（0.6ml/100mg）腹腔麻醉后处死,无菌条件下迅速取肺,采用胰酶消化、离心、反复贴壁法,分离纯化早产鼠肺成纤维细胞,并进行原代培养,经波形蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定,按1:2或3接种传代,取第三代肺成纤维细胞用于实验。四、实验方法和观察指标（一）肺形态学观察:切片进行常规HE染色,光镜下动态观察肺组织的病理改变及进行肺组织纤维化程度的判定。（二）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肺组织Ⅰ型胶原的含量。（三）免疫组化法及Western-blot技术观察和检测肺组织p16蛋白的表达状态及水平。（四）MSP和半巢式PCR检测肺组织p16基因启动子的甲基化状态。（五）半巢式PCR检测肺成纤维细胞的p16基因启动子的甲基化状态。（六）RT-PCR技术检测肺组织和肺成纤维细胞p16 mRNA表达水平。（七）免疫组化法观察肺成纤维细胞p16、PCNA的蛋白表达。（八）MTT法观察肺成纤维细胞生长活力。五、统计学分析应用SPSS11.5统计软件分析,计数资料采用x2检验,计量资料采用t检验,相关性分析采用Spearman,采用Logistic回归法求OR值（比值比）,分析关联度。显著性检验水平为0.05。结果一、肺形态学观察1、肺组织病理改变:对照组3d时终末气腔大小欠规则,数量较多,肺泡间隔稍厚;实验组3d时可见小血管扩张、充血,肺泡或间隔内有少量出血,渗出以中性粒细胞为主,肺水肿,间质内细胞增多。对照组7d时肺泡形态较规则,大小均匀;而实验组出现肺泡内出血、水肿、炎症细胞浸润、间质细胞增多,同时可见终末气腔扩张、小肺泡数量减少及肺泡分隔减少等;对照组14d和21d进行性肺泡化,肺泡分隔逐步增加,小肺泡数量增多等;同期实验组肺泡间隔更宽,有小灶或多灶状实变,肺组织正常结构破坏,终末气腔扩张更显著、小肺泡数量减少。2、肺组织纤维化评分两组3,7d肺纤维化程度无统计学差异（P＞0.05）,实验组14,21d肺纤维化评分明显高于对照组（P＜0.01）。二、肺组织Ⅰ型胶原的水平于实验后3,7d,两组比较无统计学差异（P＞0.05）,14d实验组升高（P＜0.05）,21d明显高于对照组（P＜0.01）。三、肺组织p16蛋白的表达状态及水平肺组织p16蛋白表达主要在肺间质的成纤维细胞,其次在气道黏膜上皮细胞、肺上皮细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞及肺泡巨噬细胞可见少量表达,主要定位于细胞核,少量于胞浆。两组3d无统计学差异,7d低于对照组（P＜0.05）,14,21d明显低于对照组（蛋白的半定量:P＜0.05:Western-blot:P＜0.01）。免疫组化法p16蛋白的半定量分析与Western-blot检测p16蛋白水平趋势一致。四、肺组织p16基因启动子的甲基化状态应用半巢式PCR检测p16甲基化状态,暴露高氧后,7d发生率则为50%（5/10）,14d为60%（6/10）,21d高达80%（8/10）。应用MSP检测p16甲基化状态,暴露高氧后,7d发生率则为40%（4/10）,14d为50%（5/10）,21d高达70%（7/10）。应用MSP、半巢式PCR两种方法在40例对照组不同日龄（3,7,14,21d）的早产鼠均未发现有甲基化发生。随着早产鼠暴露高氧时间的延长,甲基化发生率有增高趋势。应用半巢式和MSP技术检测检测实验组肺组织p16基因甲基化发生率分别为52.5%和42.5%,但两组方法比较无统计学差异（P＞0.05）。五、肺成纤维细胞的p16基因启动子的甲基化状态对照组的各时间点均无甲基化发生。在实验组,生后3d甲基化的发生率为16.67%,7d甲基化的发生率为33.33%,14d为50%,21d则达83.33%;与对照组比较差异显著（P＜0.01）。六、肺组织和肺成纤维细胞p16 mRNA表达水平1、肺组织p16mRNA水平3d两组无统计学差异,7d实验组低于对照组（P＜0.05）14,21d明显低于对照组（P＜0.01）。暴露高氧后的40例早产鼠,发生甲基化共21例（半巢式PCR）,与未发生甲基化19例相比,其p16 mRNA（RT-PCR技术）及蛋白（Western-blot技术）的表达水平明显降低（P＜0.01）。p16 mRNA及蛋白表达水平与甲基化相关。2、肺成纤维细胞p16 mRNA表达水平实验组和对照组比较,生后3d,两组p16mRNA水平无差异（P＞0.05）,生后7d,实验组开始减少（P＜0.05）,14d明显减少（P＜0.01）,21d达最低值（P＜0.05）。实验组中发生甲基化的p16 mRNA表达与非甲基化的比较,差异显著（P＜0.01）,且p16 mRNA表达与甲基化相关（t=3.45,P＜0.01,OR=0.846）。七、肺成纤维细胞p16、PCNA的蛋白表达1、p16的蛋白表达实验组和对照组比较,生后3d,两组p16的蛋白表达无差异（P＞0.05）,生后7d,实验组开始减少（P＜0.05）,14d明显减少（P＜0.01）,21d达最低值（P＜0.01）。2、PCNA的蛋白表达实验组和对照组比较,生后3d,两组无差异（P＞0.05）,7d实验组明显高于对照组（P＜0.01）,14d持续增加,21d达高峰（P＜0.01）。肺成纤维细胞p16mRNA表达水平与PCNA表达在14、21d呈明显负相关（r=-0.886,P＜0.05;r=-0.928,P＜0.01）。八、MTT法观察肺成纤维细胞生长活力实验组和对照组比较,生后3d,两组无差异（P＞0.05）,7d实验组高于对照组（P＜0.05）,14d继续升高,直至21d（P＜0.05）。结论1、暴露高氧中早产鼠,其肺组织的p16 mRNA及蛋白的表达水平降低,其低水平的表达状态与高氧致CLD肺纤维化的发生密切相关。2、高氧可导致早产鼠的肺组织p16基因启动子的甲基化异常,且其甲基化的发生率随高氧暴露时间的延长而逐渐增加。3、高氧诱导的p16基因启动子的高甲基化状态可能是p16 mRNA及蛋白的低水平表达的机制之一。4、高氧引发肺成纤维细胞的p16基因启动子甲基化而导致了p16基因表达水平低下,使肺成纤维细胞的细胞周期调控紊乱,最终肺成纤维细胞过度增殖,可能是早产儿CLD的肺纤维化发生的机制之一。