论文摘要
抗菌肽是生物机体内一类参与防御活动的小分子肽。人防御素属于抗菌肽家族，主要分为α族和β族。人α-防御素（humanα-defensin或human neutrophil poptide，HNP）是近年发现的人体内重要的内源性抗生素，它具有抗菌和抗病毒等活性。由于其独特的抗菌机制，使得细菌产生耐药性的可能性极大地减少，从而有可能成为新型的抗生素；在其抗病毒活性中，其抗艾滋病毒活性引起了人们的广泛关注。利用基因工程方法研制出人α-防御素已成为人们药物研发的目标。本学位论文对人α-防御素1，2，3基因在大肠杆菌中表达进行了研究。首先通过半化学合成方法获得具有大肠杆菌密码子偏爱性的3种人α-防御素基因，然后将它们分别克隆到pET-32a（+），pTWIN1以及pETR表达载体中，构建了9个相应的表达质粒。分别转化大肠杆菌BL21（DE3），ER2566以及Origami B（DE3）宿主菌株，经过表达条件的优化，结果显示，在以pET-32a（+）为表达载体，Origami B（DE3）为宿主菌的体系中获得3种人α-防御素基因高效和可溶性表达，其融合蛋白表达量占细菌总蛋白的60％以上。最佳的表达条件是：当菌体浓度达到OD600=0.6时，加入0.5mmol／L IPTG，18℃诱导16h。此外，还对表达产物HNP-2进行了纯化，利用纯化产物所作的抗菌实验表明，表达产物无抗菌活性。为了避免表达产物水解，得到更稳定的人α-防御素，以环化形式和酰胺化形式表达人α-防御素基因。本研究采用了intein作为工具，利用其可剪接extein的特点，将其N端区域和C端区域分别融合到目的蛋白编码序列的C端和N端，目的片段两端的intein片段就可将其拼接成环肽，以此为基础构建了环化表达质粒，并对表达条件进行了研究。HNP-2基因的环化表达已获得了初步结果。本研究还采用了1种新的酰胺化方法，即采用intein与HNP融合表达，intein对目的短肽进行了酰胺化修饰。通过对HNP-1，HNP-2和HNP-3的研究，在对HNP-2的酰胺化修饰上已获得一定进展。