法舒地尔对大鼠脑缺血再灌注后脑白质保护作用的研究

论文摘要

背景和目的近年来,由于缺血性脑血管病所造成的神经功能障碍已成为影响中老年人生活质量的重要因素。随着影像技术的进展,脑白质的损伤及危害越来越多的为我们所发现、认识。引起脑白质损伤最常见的原因就是缺血性脑损伤,其次还包括炎症、神经变性疾病、中毒性脑病、创伤及营养代谢障碍等。脑白质损伤能够引发传导束变性,引起运动、感觉等神经活动的联络中断而导致神经功能的障碍。中枢神经系统神经元的轴突及其周围包绕的髓鞘是构成脑白质的主要组成部分,因此对脑白质保护的研究重点在于对轴突再生及髓鞘重塑的研究。大脑白质主要由深穿支动脉供血,很容易发生缺血性损伤,而损伤后的轴突如何恢复生长或再生,脱失的髓鞘是否能够重新包绕轴突,成为目前研究的热门。Nogo-A是一种髓鞘源性抑制蛋白,主要存在于中枢神经系统神经元和少突胶质细胞中,对轴突生长表现出强烈的抑制作用。Nogo-A通过与受体NgR（Nogo receptor,一种轴突表面蛋白）相结合,激活第二信使cAMP和Ca2+,然后激活下游的Rho激酶（Rho-associated kinase,ROCK）。Rho激酶是小分子GTP酶Rho家族的成员,在细胞中的一些信号转导途径中起着分子开关的作用,在控制细胞迁移、细胞收缩、增殖、细胞凋亡中起重要作用。因此,抑制Rho激酶的激活具有脑保护作用。法舒地尔是一种新型异喹啉磺酰胺衍生物类Rho激酶选择性抑制剂,最早用于改善蛛网膜下腔出血导致的血管痉挛。法舒地尔通过对Rho激酶的特异性抑制参与了多种分子功能,如增加局部脑血流、上调eNOS的表达改善血管内皮功能、抑制中性粒细胞的迁移等对脑梗死产生保护作用；对神经再生及运动功能的恢复具有促进作用。关于法舒地尔对轴突再生的作用国内外的研究主要集中于脊髓横断伤和周围神经损伤,而对脑神经研究相对较少；而关于法舒地尔对髓鞘的保护作用未见报道。本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型,观察大鼠缺血再灌注后神经功能评分的改变和髓鞘染色的变化,利用免疫组化技术观察少突胶质细胞的特异性标记物MBP、轴突生长抑制因子Nogo-A和Rho激酶的表达变化,采用法舒地尔进行干预,探讨法舒地尔是否对脑白质具有保护作用及可能的保护机制。方法将72只成年雄性健康SD大鼠随机分为3组：假手术组、缺血再灌注组（对照组）、法舒地尔干预组（法舒地尔组）,每组24只,根据再灌注时间再分为1天、3天、7天、14天4个时间点,每个时间点6只。采用Zea-Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion reperfusion, MCAO/R）模型后,分别于相应的时间点处死大鼠,断头取脑,常规石蜡包埋,切片,分别进行髓鞘染色和免疫组化染色。对各组存活大鼠进行神经功能缺损评分；通过变色酸2R-亮绿双重染色法观察髓鞘形态变化；免疫组化法观察MBP、Nogo-A、Rho激酶表达的变化。结果1神经功能缺损评分：对照组与法舒地尔组较假手术组在相同时间点神经功能缺损症状明显,评分较假手术组均升高,差异有统计学意义（p<0.05）；法舒地尔组与对照组比较,相应时间点的神经功能评分降低,神经功能缺损症状有所恢复,相应时间点评分比较差异有统计学意义。2髓鞘染色比较：假手术组髓鞘排列呈条索状,纤维排列紧密整齐；对照组髓鞘纤维断裂、排列紊乱、疏松、有空泡形成。法舒地尔组与对照组比较,相应时间点髓鞘排列明显变整齐,空泡消失,有少量断裂。3免疫组化结果比较：3.1 MBP表达的变化：3.1.1观察缺血侧白质区MBP阳性纤维的变化：假手术组大鼠左侧白质区可见密度较高的MBP阳性纤维分布,排列整齐致密；对照组和法舒地尔组MBP阳性纤维疏散,排列紊乱。随着再灌注时间的延长,MBP表达阳性纤维密度较前增大,排列渐趋于整齐。两组相应时间点与假手术组积分光密度值比较差异有统计学意义。法舒地尔组再灌注后各时间点MBP阳性纤维较对照组相应时间点分布增多,着色增强；各时间点积分光密度值比较有统计学意义。3.1.2Nogo-A蛋白表达的变化：假手术组大鼠左侧海马可见少量Nogo-A阳性细胞分布；对照组、法舒地尔组在再灌注后1天、3天、7天的Nogo-A阳性细胞呈递增式增多,着色加深,14天开始下降,但仍高于假手术组水平；法舒地尔组Nogo-A阳性细胞表达在再灌注后各时间点均低于对照组相应时间点,与对照组比较,均有统计学意义（P<0.05）。3.1.3 Rho表达的变化：假手术组大鼠左侧海马区可见少量Rho阳性细胞分布；对照组、法舒地尔组Rho阳性细胞表达在再灌注后1天即开始增多,3天继续上升,达到高峰,7天开始下降,但仍高于假手术组水平；法舒地尔组Rho阳性细胞表达在再灌注后各时间点均低于对照组相应时间点,与对照组比较,均有统计学意义（P<0.05）。结论1、法舒地尔能够降低缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分,改善神经功能缺损症状。2、法舒地尔能够减轻急性缺血后的髓鞘脱失,并抑制轴突再生抑制因子,从而对脑白质的损伤产生保护作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述 Nogo-A、NgR、Rho/Rho激酶信号通路与神经功能重建
• 参考文献
• 个人简历
• 在校期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢