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玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性组分的制备及相关基因克隆研究

2020-11-23阅读(214)

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性组分的制备及相关基因克隆研究

论文摘要

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是一种分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的重要生防菌,对黄瓜白粉病、棉花黄萎病等多种重要植物病害均有良好的防治效果。本文对玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的生物活性组分及其相关基因进行了研究。 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在燕麦液体培养基进行摇瓶发酵培养,每1000ml发酵液可提纯获得172-2mg粗提抗生素,采用牛津杯法活性检测表明对棉花黄萎病菌、马铃薯疮痂病菌抑菌活性稳定。定量测定表明马铃薯疮痂病菌最敏感,0.3mg/ml粗提抗生素即可完全抑制其生长;粗提抗生素对变铅青链霉菌（TK24和TK54）的抑菌活性较低。薄层分析表明甲醇∶氯仿为1∶6时是粗提抗生素薄层层析的最佳展开条件,可分离出7个组分,其中组分Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ对马铃薯疮痂病菌具有抑菌活性,组分Ⅶ还对棉花黄萎病菌有抑菌活性。抗生素组分Ⅲ对马铃薯疮痂病菌的抑菌活性最强。采用制备型薄层硅胶板对抗生素组分Ⅲ进行了大量制备,TLC和HPLC分析表明薄层分离制备的抗生素组分Ⅲ纯度较高,紫外光谱最大吸收波长为198.1nm和274.5nm,与先前用HPLC制备的组分13近似。 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63对自身抗生素组分Ⅲ具有较高的耐受性,因而其基因组中有相应的抗性基因。采用鸟枪法基因克隆技术在变铅青链霉菌中克隆了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素组分Ⅲ的抗性基因,定位于1.7kb基因片段上,该基因片段有4个ORFs,ORF1编码386aa,与灰色链霉菌和天蓝色链霉菌的β-半乳糖苷酶高度同源;ORF2编码83aa,与除虫链霉菌MA-4680、天蓝色链霉菌、山丘链霉菌核糖体大亚基L2蛋白RNA结合域以及南昌链霉菌、除虫链霉菌的葡聚糖内切酶高度同源,可能是链霉菌尚未发现的新基因。ORF3编码氨基酸与动球菌（Kineococcus radiotolerans SRS30216）的醛/酮还原酶一致性和相似性均为66%。在ORF3相应位置的互补链上（1697-1352bp）存在一个ORF4,编码115aa,与除虫链霉菌的分泌蛋白（multidrug resistance protein,SpcT-like efflux protein,450aa）有较低的同源性,这一编码区应进一步亚克隆研究其功能。 采用鸟枪法以质粒pIJ702为载体在链霉菌常用宿主菌中建立了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63合成相关基因克隆文库,以马铃薯疮痂病菌为指示菌从6000个转化

论文目录

  • 引言
  • 1.链霉菌及其抗生素在植物保护上的作用
  • 2.链霉菌基因组特征及次生代谢基因簇
  • 3.链霉菌次生代谢途径研究及相关基因克隆策略
  • 4.链霉菌基因组信息与次生代谢途径改造
  • 4.1 提高菌株高产性能
  • 4.2 应用基因工程方法获得新产物
  • 5.玫瑰黄链霉菌研究进展及本项目的立题依据和意义
  • 5.1 玫瑰黄链霉菌研究进展
  • 5.2 本项目的立题依据、技术路线和研究意义
  • 第一章 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素提纯分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验菌株
  • 1.2 培养基
  • 1.3 试剂
  • 1.4 主要仪器
  • 1.5 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 链霉菌Men-myco-93-63摇瓶发酵及抗生素的提取
  • 2.2 链霉菌Men-myco-93-63粗提纯抗生素的抑菌活性定量测定
  • 2.3 链霉菌Men-myco-93-63粗提纯抗生素的薄层层析及制备
  • 2.4 链霉菌Men-myco-93-63抗生素组分Ⅲ的TLC和HPLC分析
  • 3 讨论
  • 3.1 链霉菌Men-myco-93-63的发酵及生物活性测定
  • 3.2 链霉菌Men-myco-93-63抗生素的薄层制备
  • 4 结论
  • 第二章 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗性基因克隆及表达
  • 1 材料与方法
  • 1.1 供试菌株与质粒
  • 1.2 抗生素和氨基酸
  • 1.3 工具酶及试剂盒
  • 1.4 DNA分子量标准
  • 1.5 缓冲液
  • 1.6 培养基
  • 1.7 主要仪器
  • 1.8 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 抗生素组分Ⅲ最小抑菌浓度（MIC）的测定
  • 2.2 链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA提取及部分酶切浓度的确定
  • 2.3 基因组DNA大量酶切及回收
  • 2.4 链霉菌Men-myco-93-63抗性基因的克隆及筛选
  • 2.5 抗性转化子SR228的质粒提取及酶切分析
  • 2.6 pSR228插入外源DNA片段基因序列测定
  • 2.7 pSR228的功能验证
  • 3.讨论
  • 3.1 链霉菌Men-myco-93-63抗性基因克隆的筛选
  • 3.2 pSR228外源插入片段的ORF分析与序列比对
  • 3.3 玫瑰黄链霉菌的抗性基因
  • 4.结论
  • 第三章 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素生物合成基因的克隆
  • 1.材料与方法
  • 1.1 供试菌株和质粒
  • 1.2 化学试剂及缓冲液及工具酶
  • 1.3 主要仪器
  • 1.4 试验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA酶切及转化
  • 2.2 抑菌活性转化子的筛选
  • 2.3 阳性转化子SA-3质粒提取及酶切分析
  • 2.4 pSA3的功能验证及活性检测
  • 2.5 pSA3的亚克隆及基因序列测定、分析
  • 2.6 pSA3转化变铅青链霉菌TK54菌株SA-3的抑菌活性及活性物质的提取分析
  • 3.讨论
  • 4 结论
  • 全文结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 附录A 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗性基因
  • 附录B 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63合成相关基因——pSA31外源片段
  • 附录C 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63合成相关基因——pSA32外源片段
  • 附录D 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63合成相关基因——pSA33外源片段
  • 附录E 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63合成相关基因——pSA321外源片段
  • 附录F 抗性基因ORF1系统进化树分析
  • 附录G 抗性基因ORF2系统进化树分析
  • 附录H 抗性基因ORF4系统进化树分析
  • 附录I pSA32 ORF2系统进化树分析
  • 附录J pSA321 ORF2系统进化树分析
  • 附录K 抗生素活性组分ⅢHPLC分析
  • 作者简历
  • 致谢

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