论文摘要
恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的疾病之一。其死亡率高居各种疾病之首。传统的治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化学治疗因其局限性促使人们寻找新的抗肿瘤治疗方法。近年来,随着细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展,基因治疗成为继手术治疗、放疗和化疗后的一种新型治疗手段。目前,肿瘤的基因治疗已成为备受瞩目的研究领域。课题设计构建了携带颗粒溶素（GLS）和白细胞介素12（IL-12）基因的真核共表达质粒pBM9,将其转化卡介苗,构建GLS/IL-12重组卡介苗;建立小鼠黑色素瘤模型,观察了肿瘤局部注射重组BCG的抗瘤作用。第一部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表达质粒pBM9的构建及表达目的:构建能分泌表达人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表达质粒pBM9,并检测其表达。方法:将GLS分泌肽的编码序列加入到引物序列中,以含GLS基因（不含分泌肽）的质粒pZMO3为模板,采用PCR扩增出含分泌肽基因的人GLS活性肽基因。然后定向克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1的多克隆位点,构建GLS活性肽的真核表达质粒pBudCE4.1-S9K,测序确认正确。将质粒pZMO2中的小鼠白细胞介素12（murine interleukin 12,mIL-12）亚克隆到pBudCE4.1-S9K,构建真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。将质粒pZMO3中的分枝杆菌复制子Orim亚克隆到质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的NheI位点中形成真核穿梭共表达质粒pBM9。将其转染细胞后,以RT-PCR,、免疫组化和ELISA检测试剂盒检测GLS和mIL-12的表达与分泌。结果:成功扩增出含分泌肽编码序列的人GLS活性肽基因。构建的真核表达质粒pBudCE4.1-S9K经PCR,双酶切和双向测序鉴定基因序列完全正确。真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12转染细胞,经RT-PCR扩增出特异性267bp和1632bp左右的GLS基因和mIL-12基因条带;经免疫细胞化学检测到转染细胞内明显的棕黄色表达颗粒;转染细胞上清中用ELISA试剂盒检测到mIL-12的分泌。结论:成功构建能分泌表达人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表达质粒pBM9。第二部分携带人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的重组BCG的构建目的:构建携带人GLS活性肽与小鼠IL-12基因的重组BCG,并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。方法:制备BCG感受态,以电转化的方式将pBM9质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;并在含Zeocin抗生素的Middlebrook 7H10平板上反复传代培养,鉴定BCG携带质粒的稳定性。以相同方法构建含pBMS,pBM12质粒的重组BCG作为动物实验对照菌。通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果:电转化方式可将pBM9K导入BCG,该重组BCG能在含Zeocin抗生素的Middlebrook 7H10平板生长和传代,抽提质粒鉴定出与GLS基因与mIL-12基因相符的目的条带。携带质粒的重组BCG在Zeocin抗生素的Middlebrook 7H10平板传代培养至少10代。用含pBM9的重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96h后用RT-PCR法也扩增出267bp左右和1632bp左右的基因条带。结论:成功构建含pBM9的重组BCG;及含pBMS,pBM12质粒的重组BCG。携带质粒的重组BCG能稳定传代10代。重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。第三部分重组BCG诱导正常小鼠免疫应答的研究目的:观察重组BCG免疫正常小鼠后诱导免疫应答的能力。方法:C57BL/6J纯系小鼠以1×105CFU/50μl的重组BCG尾部皮内注射。免疫分为8组,分别用生理盐水,BCG,pBM9重组BCG,pBM12重组BCG,pBMS重组BCG,pBM9质粒,pBM12质粒,pBMS质粒尾部皮下注射。免疫程序为0d、7d、14d各一次。第一次免疫后4周,摘除小鼠眼球取血,引颈处死小鼠。自然凝固后取血清进行细胞因子检测。分别按小鼠IL-12、IFN-γ和TNF-αELISA试剂盒说明操作。比较各组间细胞因子水平差异。结果:各重组BCG组和质粒组血清IFN-γ水平明显高于生理盐水对照组（P＜0.05）,且pBM9重组BCG组和pBM12重组BCG组血清IFN-γ水平明显高于BCG组（P＜0.05）。各重组BCG组和质粒组血清IL-12水平明显高于生理盐水对照组（P＜0.05）,pBM12重组BCG组血清IL-12水平外明显高于BCG组（P＜0.05）,其余两组重组BCG血清IL-12水平则与BCG组差异无显著意义（P＞0.05）。各重组BCG组和质粒组血清TNF-α水平明显高于生理盐水对照组（P＜0.05）,各重组BCG组血清TNF-α水平与BCG组无显著差异（P＞0.05）。结论:重组BCG具有明显诱导C57BL/6J细胞免疫应答的能力。第四部分携带GLS与IL-12真核共表达质粒重组BCG局部注射抗肿瘤实验目的:建立小鼠黑色素瘤模型,观察含pBM9、pBM12、pBMS的重组BCG局部瘤内注射的抗瘤效果。方法:C57BL/6J纯系小鼠于前肢右侧腋下皮下接种肿瘤细胞B16,每鼠106细胞（0.1ml细胞悬液）,待肿瘤长到1cm大小时,取瘤组织病理切片HE染色确认肿瘤模型。以肿瘤接种后1,4,7,10d开始治疗,确定治疗起始时间。治疗分5组,分别用生理盐水,BCG,含pBM9,pBM12,pBMS质粒的重组BCG进行瘤内注射治疗,从肿瘤接种后1天开始治疗,每次0.1ml,一周一次共4次。隔日观察肿瘤生长情况,测量肿瘤大小和观察带瘤存活期。取肿瘤组织行病理切片HE染色观察肿瘤病理变化。取小鼠血清用ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL-12的变化。结果:皮下接种B16细胞的C57BL/6J能形成肿瘤,病理检查可见典型黑色素瘤细胞。小鼠从接种肿瘤后1天开始治疗,效果最好。用含pBM9质粒的重组BCG以108/ml进行治疗,肿瘤生长受抑制,肿瘤大小明显小于同期的生理盐水对照组（p＜0.05）;病理检查见BCG组与各重组菌治疗组在肿瘤组织周围有大量淋巴细胞浸润;小鼠血清中的IL-12和IFN-γ升高（p＜0.05）;小鼠荷瘤生存时间延长（p＜0.05）。结论:携带pBM9质粒的重组BCG瘤内注射对小鼠黑色素瘤有一定的治疗作用。