脂肪因子内脂素和Chemerin在代谢综合征发病机制中的作用研究

论文摘要

目的：代谢综合征（Metabolic syndrome, MS）是以中心性肥胖为特征的一组代谢紊乱临床症候群,包括2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）、高血压、血糖和血脂紊乱等。MS的发病机制十分复杂,是遗传与环境因素相互作用的结果,而胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）是MS的病理生理基础。研究发现肥胖引起脂肪组织源性细胞因子内脂素（visfatin）和chemerin表达异常,而内脂素一方面促进脂肪堆积,参与炎症、免疫反应,另一方面又结合并激活胰岛素受体行使降血糖的作用；Chemerin作为新发现的具有趋化因子性质的脂肪因子,既有激活巨噬细胞的特点,又可增强胰岛素受体底物-1（Insulin receptor substrate-1,IRS-1）酪氨酸的磷酸化水平,改变胰岛素敏感性。因此,内脂素和chemerin在MS的发生发展中可能具有重要作用。基于维吾尔族肥胖和2型糖尿病均具有较高的患病率,本研究分别以维吾尔族MS患者、MS大鼠和3T3-L1前脂肪细胞作为研究对象,利用real time RT-PCR、半定量RT-PCR、Western blot、ELISA及免疫组化等技术,分别从脂肪组织和脂肪细胞mRNA及蛋白质表达、血浆蛋白质等多个水平,探讨内脂素和chemerin在糖、脂代谢中的作用以及与脂肪形成的关系,为研究二者在MS发病机制中的可能作用提供实验依据。方法：1.维吾尔族人群临床生化指标检测：代谢综合征诊断根据2005年国际糖尿病联盟通过的MS全球共识定义进行研究样本的纳入和排除。81例研究的对象分为MS组（39例；男16,女23）和非MS组（42例；男18,女24）。研究对象测量身高、体重、腰围（WC）、臀围（HC）,并计算体重指数（BMI）与腰臀围比（WHR）。所有研究对象术前禁食8h以上,手术当天平卧,分别测量收缩压（SBP）与舒张压（DBP）;采集肘静脉血5mL,分别测量空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等生化指标。2.人大网膜和皮下脂肪组织内脂素和chemerin mRNA表达检测：利用手术中留取的大网膜和皮下脂肪组织,提取脂肪组织总RNA、经逆转录获得cDNA,内脂素通过半定量RT-PCR,chemerin通过real time RTPCR分别获得候选脂肪因子在大网膜和皮下脂肪组织的表达水平。3.健康4-6周龄、体重100-120克的SD雄性大鼠90只,随机分为正常对照（NC）组、MS模型正常盐（NS）组及MS模型高盐（HS）组各30只,分别给予基础饲料、高脂高糖饲料和高脂高糖高盐饲料。10周末,两模型组中选择腹围达标的大鼠,给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）。同时每2-4周测量体重、体长、腹围、血压、空腹血糖和血脂（TG、HDL-C、LDL）等。半定量RT-PCR法检测MS大鼠不同部位脂肪组织内脂素和chemerin的mRNA表达水平。4.人及大鼠血浆内脂素和chemerin采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。5.体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在3T3-L1前脂肪细胞生长至95%单层细胞覆盖培养瓶后2天,采用3-异丁基-1甲基黄嘌呤（IBMX）、胰岛素、地塞米松联合方案诱导其分化；诱导分化过程中使用油红O染色鉴定脂肪细胞分化情况。分别于诱导分化的第0、2、4、6、8、10、12天采集细胞,采用半定量RT-PCR法分别检测内脂素和chemerin mRNA的表达水平,用Western blot的方法检测脂肪细胞中内脂素和chemerin蛋白质的表达。同时在3T3-L1细胞诱导成熟后,分别以不同浓度梯度（0、25ng/ml、50ng/ml、l00ng/ml、200ng/ml）的重组小鼠chemerin蛋白作用于细胞,分别在干预12、24、48小时后收集细胞,半定量RT-PCR法检测内脂素、MCP-1等基因的mRNA表达情况。结果：1.维吾尔族人群研究结果：1)MS组和非MS组临床特征和生化资料显示,MS组BMI、WC、HC、WHR, TG、FPG, HOMA-IR和SBP均显著高于非MS组（P<0.01～P<0.05）,HDL-C显著低于非MS组（P=0.016）,而年龄、LDL-C、DBP和FINS等的差异无统计学意义；2)大网膜和皮下脂肪组织内脂素和chemerin mRNA表达水平：①内脂素mRNA的表达量在MS组和非MS组间的差异无统计学意义,并且在两组的表达水平大网膜脂肪组织均低于皮下脂肪组织,但差异无统计学意义；进行性别分组后,其差异也无统计学意义；②大网膜和皮下脂肪组织chemerin mRNA表达水平MS组均较非MS对照组升高,但差异无统计学意义；按性别分组后,两组皮下和大网膜脂肪组织chemerin mRNA表达水平也均无显著性部位差异；3)血浆内脂素和chemerin水平MS组均显著高于非MS组（P<0.01-P<0.05）。进行性别分组后,女性血浆chemerin水平MS组较非MS组有显著升高（P=0.001）,男性MS组虽然较非MS组有升高,但差异无统计学意义；4)相关分析：①网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量与HOMA-IR呈正相关；血浆内脂素与TC、TG及LDL显著正相关；②观察对象总体皮下脂肪组织chemerin mRNA表达量与大网膜脂肪组织chemerin mRNA表达量显著正相关,与血浆chemerin水平显著正相关；血浆chemerin水平与年龄、TG、WHR及HOMA-IR显著正相关。进一步以血浆chemerin水平为应变量进行多元逐步回归分析,进入回归方程的因素为年龄、TG和WHR。2.MS动物模型研究：1)体重和腹围：分别在第4周、8周和14周末,NS组和HS组大鼠的体重、腹围均较NC组升高,差异有统计学意义（P<0.05）；2)血糖：在第14周末,NS组和HS组大鼠的血糖水平均较NC组显著升高（P<0.05）。与NS组相比,HS组大鼠的血糖显著高于NS组（P<0.05）；3)血脂：14周末,与NC组相比,NS组和HS组大鼠的TG和LDL-C增大,HDL-C降低,差异有统计学意义（P<0.01）；HS组大鼠的TG和LDL-C高于NS组,且差异有统计学意义（P<0.05）,HDL-C低于NS组,差异有统计学意义（P<0.05）；4)血压：在14周末,HS组血压与NS组和NC组相比均有所增高,但差异无统计学意义（P>0.05）。3.MS大鼠内脂素和chemerin的表达水平：1)内脂素和chemerin在不同部位脂肪组织mRNA的表达水平：大鼠网膜、肾周、附睾旁及肩胛肌旁4个不同部位脂肪组织内脂素的mRNA表达水平模型组均较对照组有所降低,除肩胛肌旁的表达水平差异在两组有统计学意义（P<0.05）外,其余3个部位的表达水平差异均无统计学意义。大鼠肾周、附睾旁及肩胛肌旁3个不同部位脂肪组织chemerin的mRNA表达水平模型组均较对照组升高,差异有统计学意义（P<0.05）。模型组和对照组大鼠脂肪组织内脂素和chemerin的mRNA表达水平均不存在显著性部位差异；2)血浆内脂素和chemerin的蛋白质表达水平：内脂素浓度MS模型组低于对照组,chemerin水平MS模型组高于对照组,但差异均无统计学意义。4.MS大鼠模型脂肪异位沉积：MS模型组大鼠肝细胞内脂肪空泡形成,有大量脂滴,部分肝组织出现弥漫性脂肪变性；MS大鼠骨骼肌组织肌纤维部分扭曲,骨骼肌间质中有脂肪沉积。5.在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,内脂素mRNA随细胞分化表达逐渐升高,至分化末期达到较高水平且趋于稳定。其中,诱导分化后第6-12天较分化第0天显著升高（P<0.05）,诱导分化第10-12天较第2-6天显著升高（P<0.01）。诱导分化第12天较第6-8天显著升高。Chemerin mRNA表达也随着细胞分化逐渐升高,分化至第6天达到较高水平且逐渐趋于稳定。其中,诱导分化后第2-12天均较分化第0天显著升高（P<0.01）,并且从第2天开始,每经过6天,其表达均较前面的时间段显著升高（P<0.01）。同时随着脂肪细胞分化成熟,内脂素和chemerin基因的蛋白表达水平均逐渐增高。6.重组小鼠chemerin蛋白作用于成熟3T3-L1脂肪细胞24小时后,100ng/ml干预组内脂素的表达与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）; 50ng/ml l00ng/ml、200ng/ml重组小鼠chemerin蛋白干预组MCP-1的表达与未干预组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；作用48小时后,50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml重组小鼠chemerin蛋白干预组与对照组相比均上调了内脂素与MCP-1的表达（P<0.05）。结论：1.维吾尔族MS人群具有明显的中心性肥胖、糖耐量受损及血脂紊乱等临床特点；该人群血浆内脂素和chemerin水平均显著升高,腹部大网膜和皮下脂肪组织内脂素mRNA和chemerin表达水平均增高,表达无显著性部位和性别差异。相关分析结果提示,内脂素可能参与调节脂肪细胞中脂肪颗粒的形成,与脂代谢有直接效应；chemerin可能在维吾尔族MS人群的中心性肥胖、甘油三酯水平升高、胰岛素抵抗的发生发展中起作用。2.代谢综合征大鼠肾周、附睾旁脂肪组织chemerin的mRNA表达水平均显著高于对照组大鼠,提示该脂肪因子在中心性肥胖发生中的作用,高脂、高糖膳食可能是引起chemerin基因表达增高的原因之一。SD大鼠脂肪组织内脂素的mRNA表达水平无显著性部位差异。在代谢综合征大鼠的肝脏出现脂肪变性病理改变,骨骼肌出现脂肪颗粒沉积,提示存在脂肪的异位转移。3.在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中,内脂素和chemerin的mRNA和蛋白质表达趋势均与脂质积聚过程呈现较好的一致性,提示内脂素和chemerin基因功能与脂肪细胞成熟及脂质积聚有关,且chemerin蛋白上调成熟3T3-L1脂肪细胞中内脂素与MCP-1基因的表达,该细胞因子可能在肥胖患者的白色脂肪形成中具有重要的生物学功能。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 内脂素和chemerin在维吾尔族代谢综合征发病机制中作用
• 1. 研究背景与目的
• 2. 内容与方法
• 2.1 研究对象
• 2.2 材料与方法
• 2.3 主要仪器
• 2.4 统计学分析
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第二部分 内脂素和Chemerin在MS大鼠脂肪组织的表达变化及作用
• 1. 研究背景与目的
• 2. 内容与方法
• 2.1 MS大鼠模型的建立
• 2.2 内脂素和chemerin在MS大鼠脂肪组织和血浆表达水平的检测
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 统计学分析
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第三部分 内脂素和Chemerin与3T3-L1前脂肪细胞分化的关联及其与MS的关系
• 1. 研究背景与目的
• 2. 内容与方法
• 2.1 材料与方法
• 2.2 细胞实验以及mRNA表达检测
• 2.3 Western blot实验
• 2.4 主要仪器设备
• 2.5 统计学分析
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 总结
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 个人简历
• 导师评阅表