纳豆激酶液体发酵的研究

论文摘要

纳豆激酶（Nattokinase,NK）是由纳豆菌发酵大豆产生的蛋白酶。我国研究人员在纳豆激酶高产菌株的筛选、发酵条件的优化、纳豆激酶的纯化及其酶学性质等方面均进行了研究,并取得一定进展,但从目前的研究情况来看,纳豆激酶的产量仍不高,难以满足需要。本研究以实现纳豆菌液体发酵为目的,取得高产量的纳豆激酶。经紫外诱变处理得到菌株ZN-200815,实验证实ZN-200815不仅发酵液单位酶活力高,而且稳定性好,故选取ZN-200815作为生产菌种,其发酵液单位酶活力为1783u/mL。进行了纳豆激酶发酵生产条件100升罐发酵扩大试验,优选出发酵培养基和最佳发酵条件;在500升发酵罐上进行培养基和培养条件的进一步优化,提高了纳豆激酶的表达量,同时降低了生产成本;对液体发酵纳豆激酶的发酵过程进行调节控制:为了提高纳豆激酶的表达量,根据菌株生长速度的快慢,适当控制其接种量和接种时间。改善温度、pH、供气量及拌搅转速发酵条件等,对诱导剂条件改进,使菌体生长与纳豆激酶表达的诱导相调协。100L和500L中试的发酵液的纳豆激酶酶活力在1926～2417U/mL,平均值分别为2242 U/mL、2238.7U/mL,500L罐的表达效率比50升罐提高了18.7%,分泌到胞外的比率提高15.2%。进行了纳豆激酶分离纯化小试和扩大试验,纯化后的纳豆激酶纯度为92.9%。进行了纳豆激酶冻干粉剂的研制,研究出一套纳豆激酶冷冻干燥工艺。进行了纳豆激酶酶学性质的研究,包括温度、pH、离子及EDTA等对纳豆激酶活性的影响和纳豆激酶的保存稳定性试验。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 纳豆菌简介
• 1.2.1 纳豆菌在细菌学上定义
• 1.2.2 纳豆菌的形态和生理特征
• 1.2.3 纳豆菌的作用
• 1.3 纳豆激酶研究进展
• 1.3.1 技术发展现状和趋势
• 1.3.2 国内外同类产品和技术情况
• 1.3.3 项目特色
• 1.3.4 市场预测和发展趋势
• 1.4 研究主要内容和意义
• 第二章 纳豆菌种的复壮、改良和优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 纳豆激酶酶活力测定方法
• 2.2.2 复壮方法
• 2.2.3 改良和优化方法
• 2.2.4 鉴定方法
• 2.2.5 结果与分析
• 2.2.6 鉴定结果
• 2.3 本章小结
• 第三章 纳豆激酶50L 发酵工艺条件优化
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验结果
• 3.3 50L 罐发酵放大试验
• 3.3.1 主要设备和仪器
• 3.3.2 主要原料和试剂
• 3.3.3 研究采用的工艺路线为
• 3.3.4 试验方法
• 3.4 结果和讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 100L 和500L 罐发酵扩大试验
• 4.1 试验方法
• 4.1.1 100L 和500L 发酵培养基的优化
• 4.1.2 100L 和500L 发酵培养条件的优化
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 100L 和500L 发酵培养基优化结果
• 4.2.2 发酵前期24h 内未补加葡萄糖与补加葡萄糖的产酶比较
• 4.2.3 接种量对发酵酶活力的影响
• 4.3 本章小结
• 第五章 纳豆激酶的分离纯化和冻干粉制备
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料与试剂
• 5.1.2 测定方法
• 5.1.3 电泳方法
• 5.1.4 分离纯化方法
• 5.1.5 纳豆激酶冻干试验方法
• 5.1.6 纳豆激酶酶学性质研究试验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 硫酸铵盐析结果
• 5.2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow 层析
• 5.2.3 CM-Sepharose Fast Flow 层析
• 5.2.4 Penpyl- Sepharose Cl-48 层析
• 5.2.5 优化的分离纯化步骤
• 5.2.6 电泳结果分析
• 5.2.7 纳豆激酶分离纯化扩大试验
• 5.2.8 纳豆激酶冻干粉研制试验
• 5.2.9 纳豆激酶酶学性质研究试验结果
• 5.3 本章小结
• 结论与展望
• 一、结论
• 二、创新点
• 三、展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件