论文摘要
昆虫酚氧化酶原（prophenoloxidase，pro-PO）系统是昆虫血淋巴中局限发生的、被严格调控的天然免疫机制之一。其为丝氨酸蛋白级联反应，由模式识别蛋白、若干丝氨酸蛋白酶原、酚氧化酶原及某些调控因子等组成，可被入侵至机体的病原体表面的特征性标志物激活，通过最终形成黑色素，参与昆虫体内的黑化反应、创伤修复和血液凝固反应等。对pro-PO系统的研究，可为脊椎动物体内类似的丝氨酸蛋白酶联反应，如补体系统和凝血系统的发生及调控机制提供有意义的参考。目前这样的研究主要集中于pro-PO的激活过程，而对其终端步骤，PO介导的黑色素合成的发生和调控机制所知甚少。本研究以黄粉虫幼虫血淋巴中的pro-PO系统为对象对此进行了初步探讨。首先采用SDS-PAGE对体外诱导的血淋巴黑色素合成反应中的蛋白质变化进行了分析，发现了六条蛋白带呈时间依赖性地从反应液中消失；PO抑制剂—PTU在阻断PO介导的黑色素合成的同时，亦阻止了这六条蛋白带的消失，提示这些蛋白与PO介导的黑色素合成密切相关，故称其为黑化相关蛋白（MAP）-1～6。对其进行N端氨基酸序列分析表明，MAP-1、2为已知的黑化增强剂，黄粉虫卵黄素样蛋白的不同聚合体；MAP-3因N端序列被封闭而未知；MAP-4、5均为未知蛋白；MAP-6为黄粉虫的干燥蛋白，在黑色素合成中的功能未知。对其中未知的MAP-5进行了进一步的研究。首先采用电洗脱的方法获得纯化的变性MAP-5，并对其进行部分氨基酸序列分析，获得四个MAP-5的部分氨基酸序列。以此设计DNA探针，通过对MAP-5的cDNA克隆得知，MAP-5是由1056个核苷酸编码，包含352个氨基酸的新蛋白，全部序列内共有三个N联糖基化位点，与目前NCBI数据库中的已知蛋白均无同源性；其序列中部含有由11个连续的Asp构成的Asp-富集区，该Asp-富集区与几种功能各不相关的蛋白质有同源性。为了对MAP-5在黑色素合成中的功能进行研究，利用纯化的变性MAP-5，制备了MAP-5多克隆抗体并进行纯化。通过凝胶过滤层析和阴离子交换层析等技术，从黄粉虫幼虫血淋巴中纯化获得天然MAP-5。通过DNA重组技术构建MAP-5的重组质粒，利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，在HighfiveTM细胞系成功地表达了重组MAP-5，这些为随后MAP-5的生物学功能研究奠定了基础。pro-PO系统的激活及其介导的黑色素合成反应，是昆虫体内清除病原体的重要体液免疫机制，但过度的黑色素合成亦可对宿主的正常组织造成伤害，因此，昆虫体内存在着内源性抑制剂，以调节pro-PO系统的激活至恰当的水平，避免过早或过度的激活。在本研究中，纯化的nMAP-5和rMAP-5均可剂量依赖性地抑制黄粉虫幼虫血淋巴的体外黑色素合成反应；RNAi实验也发现，内源性MAP-5基因表达沉默的幼虫血淋巴的黑色素合成反应明显增强，这些均提示MAP-5为黄粉虫体内一种内源性黑色素合成抑制剂。rMAP-5对pro-PO系统中丝氨酸蛋白酶的活性和PO的活性均无影响，提示其抑制作用是通过对黑色素合成的最后一步，PO介导的黑色素合成反应的抑制来实现的，为首次发现的对PO介导的黑色素合成具有抑制作用的蛋白，将其命名为黑化抑制蛋白。MAP-5与血淋巴中卵黄素样蛋白、PO的降解片断、MAP-3及一种35kDa的未知蛋白形成复合物，提示它们关系密切，它们之间的相互作用可能与MAP-5抑制作用的发生有关。对MAP-5的组织学定位发现，MAP-5为一种黄粉虫幼虫的血浆蛋白。综上，MAP-5是首次发现的黄粉虫体内的一种黑化抑制蛋白，其发现为昆虫pro-PO系统的调控提出了新的作用靶点和调控机制，故对其作用机制及其他MAPs的研究还有待于进一步的深入和完善。
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标签：天然免疫论文; 黄粉虫论文; 酚氧化酶原论文; 富集区论文; 黑色素论文; 黑化反应论文; 黑化抑制蛋白论文; 昆虫论文;