论文摘要
背景与目的: 癌症的发病率和死亡率主要取决于癌细胞的器官特异性转移与否和对转移癌细胞化疗的成功与否。转移绝不是一个随机的过程,每种肿瘤都有其转移的好发部位。例如,乳腺癌倾向于转移到局部淋巴结、肺、肝和骨;前列腺癌则通常向骨转移。尽管与癌细胞转移相关的基因的研究有了长足的进步,但对能促进癌细胞在转移部位种植、存活和增殖的基因知之甚少。Muller等的研究显示,基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1, SDF-1）充当了一种对乳腺癌癌细胞定向转移过程起关键作用的细胞因子,一旦癌细胞迁移至特定的器官,SDF-1与其专用受体CXCR4构成的生物学轴激活的特殊信号传导途径,对癌细胞在转移好发部位种植、存活和增殖起关键的作用。用抗体功能性地封闭CXCR4可以明显降低癌细胞向淋巴结和肺的转移。近年来,RNAi干扰技术因其能特异、高效地使靶细胞沉默,而成为基因功能研究的强有力的工具。本研究选用高表达CXCR4的乳腺癌细胞T47D,利用RNAi干扰技术封闭CXCR4的表达,然后检测癌细胞的侵袭转移能力是否受到抑制,以期待寻找一条抗肿瘤转移的新途径。 方法: 第一部分:选择人乳腺癌细胞系T47D,它是一株CXCR4基因较高表达的细胞系。siRNA表达载体选择Ambion公司的pSliencer 3.1-H1 neo载体。首先,从CXCR4基因序列中选取4段19nt的片断,设计并合成8条互补的DNA序列,经退火形成双链,连接质粒载体,形成pSliencer 3.1-H1 neo/siRNA1、pSliencer 3.1-H1 neo/siRNA2、pSliencer 3.1-H1 neo/siRNA3和pSliencer 3.1-H1 neo/siRNA4等四种质粒。然后转化质粒到大肠杆菌中,经过克隆、筛选、扩增,提取质粒,酶切并测序鉴定。再将纯化质粒转染到T47D细胞中,在H1启动子作用下,质粒在细胞内转录生成具有3’突出发卡RNA。G418
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