chTNT-3介导的主动靶向脂质体的研究

论文摘要

脂质体是一种由磷脂双分子层构成的具有水相内核的脂质微囊。通过表面修饰可以改变脂质体的性质和生物学行为：在脂质体表面修饰亲水性高分子（如聚乙二醇）可以阻碍血浆成分的调理作用，减少脂质体被网状内皮系统（RES）识别和摄取，使脂质体具有长循环的特点；在脂质体表面修饰特异性的配基（如抗体，多肽），能使脂质体具有主动靶向的特性。人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗（chemic TNT-3 monoclonal antibody，chTNT-3）是一种能特异性亲和肿瘤坏死区细胞核抗原的新型抗体。chTNT-3可特异性结合肿瘤坏死区暴露的单链DNA，定位在肿瘤坏死部位。由于实体瘤内部坏死区域的存在相当普遍，chTNT-3突破了常规肿瘤细胞单抗的局限，具有广谱抗肿瘤的特点。本文选择chTNT-3作为靶向头基，制备了两种chTNT-3介导的主动靶向脂质体给药系统，并比较两种不同方式chTNT-3介导的主动靶向脂质体对肿瘤的靶向性：（1）空间稳定免疫脂质体通过脂质体表面的chTNT-3与肿瘤坏死部位的特异性结合作用靶向至肿瘤；（2）将生物素化chTNT-3（chTNT-3/B）预定位于荷瘤裸鼠的肿瘤坏死部位，再给予表面修饰链霉亲和素的空间稳定脂质体，通过生物素与链霉亲和素之间特异性结合作用将脂质体靶向至肿瘤。以阿霉素为模型药物，考察chTNT-3介导的主动靶向脂质体对荷瘤裸鼠的药效。首先合成了脂质体空间稳定膜材料甲氧基聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺（mPEG-HSPE）和用以连接抗体的功能性膜材料吡啶二硫丙酰胺-聚乙二醇-氢化大豆磷脂酰乙醇胺（PDP-PEG-HSPE），TLC、IR、1H-NMR等初步鉴定为目的产物，符合试验要求。主动靶向脂质体的制备包括两方面：（1）采用高压均质机或微型挤出器制备粒径均一的含PDP-PEG-HSPE的空间稳定脂质体（PDP-SL），通过硫酸铵梯度法包载模型药物阿霉素。以阿霉素包封率和载药量为指标，通过三因素五水平的星点设计-效应面优化法优化处方，得到较优的脂质体处方为：膜材料摩尔比为HSPC/CHOL/mPEG-HSPE/PDP-PEG-HSPE=5：4：0.2：0.05，药脂比0.18：1（w/w），包载温度65℃，包载时间20min时，包封率可达（93.2±2.0）％。（2）PDP-SL经二硫苏糖醇还原，得表面带巯基的脂质体（HS-SL），与马来酰亚胺苯基丁酰基chTNT-3（MPB-chTNT-3）连接得到空间稳定免疫脂质体（chTNT-3-SL）。另一方面，HS-SL与马来酰亚胺苯基丁酰基链霉亲和素（MPB-SAv）连接可得预定位脂质体（SAv-SL）；chTNT-3经生物素衍生化得到生物素取代度为3～8的chTNT-3/B，由chTNT-3/B和SAv-SL组成预定位脂质体给药系统。连接单抗或链霉亲和素后，chTNT-3-SL和SAv-SL的平均粒径分别从PDP-SL的102nm增大到123nm和114nm，脂质体表面抗体密度或链霉亲和素蛋白密度为1089μg/μmol PL和51.5μg/μmol PL，连接效率分别为69.8％和82.6％。建立相应ELISA法，测定chTNT-3衍生物的免疫活性，结果表明chTNT-3衍生化后的免疫活性几乎完全保留；chTNT-3通过共价方式连接到脂质体表面后，仍然在一定程度上保留了抗体的免疫活性。初步稳定性试验表明，chTNT-3-SL和SAv-SL在4℃贮存14d，两者的平均粒径及分布变化小，药物泄漏少于3％，chTHT-3-SL的相对免疫活性保持不变，理化性质较稳定。为验证主动靶向脂质体的体外靶向性，建立了模拟肿瘤坏死部位的固定Raji细胞模型，制备包载钙黄绿素的主动靶向脂质体，利用荧光分析法验证空间稳定免疫脂质体和预定位脂质体给药系统与固定Raji细胞的特异性结合作用。结果表明，两种主动靶向脂质体给药系统与固定Raji细胞的结合量均显著高于阴性对照组（P＜0.001）。以阿霉素为模型药物，制备了阿霉素空间稳定免疫脂质体（chTNT-3-SL[DXR]）和预定位脂质体给药系统（chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]）。HPLC法测定了大鼠单剂量静注两种主动靶向脂质体及对照组空间稳定脂质体后阿霉素在大鼠体内的药动学参数，SL[DXR]、chTNT-3-SL[DXR]和（chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]）的t1/2分别为21.9h，21.6h和15.0h；AUC0-72分别为22411μg·h/mL，1440μg·h/mL和1138μg·h/mL；MRT0-72分别为20.1h，16.9h和13.8h。荷瘤裸鼠组织分布结果表明，预定位脂质体组4h和24h在肿瘤部位的阿霉素浓度最高，4h时显著高于SL组和游离阿霉素组（P＜0.05）；48h空间稳定免疫脂质体在肿瘤部位的浓度最高。荷瘤裸鼠药效试验表明，chTNT-3-SL[DXR]和chTNT-3/B+SAv-SL[DXR]抗皮下移植瘤各有优点，前者的后续药效较好（相对体积抑瘤率59.5％），后者的某个中间时相段药效较好（相对体积抑瘤率61.9％），高于非免疫SL[DOX]（相对体积抑瘤率49.1％）。

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英文缩略语注释

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Abstract

前言

研究背景

1.恶性肿瘤

2.脂质体

3.肿瘤坏死靶向治疗

4.生物素-（链霉）亲和素预定位系统

课题设计和研究内容

参考文献

第一章磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物的合成

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法与结果

2.1 mPEG-HSPE的合成

2.1.1 合成工艺

2.1.2 合成产物鉴定

2.1.2.1 TLC分析

2.1.2.2 红外扫描分析

2.1.2.3 核磁共振分析

2.1.2.4 DSC分析

2.2 PDP-PEG-HSPE的合成

2.2.1 合成工艺

2.2.2 合成产物鉴定

2.2.2.1 TLC分析

2.2.2.2 红外扫描分析

2.2.2.3 核磁共振分析

2.2.2.4 DSC分析

2.2.2.5 PDP含量测定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第二章空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体给药系统的制备与影响因素

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法与结果

2.1 阿霉素体外分析方法（UV法）的建立

2.2 磷脂（PL）中磷含量分析方法的建立

2.3 阿霉素空间稳定脂质体的制备及影响因素考察

2.3.1 脂质体制备

2.3.2 阿霉素包封率测定

2.3.3 载药温度对包封率的影响

2.3.4 载药时间对包封率的影响

2.3.5 脂质体膜材料对包封率的影响

2.3.6 药脂比对包封率的影响

2.3.7 磷脂浓度对包封率的影响

2.3.8 脂质体粒径对包封率的影响

2.4 星点设计-效应面优化法优化脂质体处方

2.4.1 试验设计

2.4.2 模型拟合及预测

2.4.3 PDP脂质体处方预测

2.5 脂质体的浓缩

2.6 chTNT-3蛋白含量测定

2.7 阿霉素空间稳定脂质体的制备及影响因素考察

2.7.1 MPB-chTNT的制备

2.7.2 空间稳定免疫脂质体的制备

2.7.3 空间稳定免疫脂质体抗体密度的测定

2.7.4 抗体磷脂比对抗体结合率的影响

2.7.5 反应时间对抗体结合率的影响

2.7.6 反应温度对抗体结合率的影响

2.8 预定位脂质体给药系统的制备及影响因素考察

2.8.1 chTNT-3/B的制备

2.8.2 chTNT-3/B中生物素取代度测定

2.8.2.1 标准曲线制备

2.8.2.2 样品测定方法

2.8.3 不同生物素抗体比对取代度的影响

2.8.4 不同反应时间对取代度的影响

2.8.5 MPB-SAv的制备

2.8.6 SAv-SL[DXR]的制备

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体给药系统的理化性质考察

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法与结果

2.1 空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体的粒径分布

2.1.1 制备工艺对粒径分布的影响

2.1.1.1 过膜次数对粒径分布的影响

2.1.1.2 磷脂浓度对粒径分布的影响

2.1.2 空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体的平均粒径和粒径分布

2.2 脂质体形态观察

2.3 chTNT-3衍生物及空间稳定免疫脂质体的免疫活性检测

2.3.1 ELISA方法的建立

2.3.1.1 细胞核抗原的提取

2.3.1.2 ELISA基本操作方法

2.3.1.3 ELISA中最佳核抗原包被量的筛选

2.3.1.4 ELISA中最佳二抗浓度的筛选

2.3.1.5 ELISA中最佳封闭条件的筛选

2.3.1.6 ELISA最优条件的确定

2.3.2 chTNT-3衍生物的免疫活性检测

2.3.3 空间稳定免疫脂质体的免疫活性检测

2.4 阿霉素空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体的药物释放考察

2.4.1 阿霉素体外分析方法（直接荧光测定法）的建立

2.4.2 阿霉素脂质体的体外释放

2.5 空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体稳定性的初步考察

2.5.1 粒径稳定性考察

2.5.2 药物泄漏考察

2.5.3 免疫活性稳定性考察

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体给药系统的体外靶向性

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

2 方法与结果

2.1 固定Raji细胞模型的建立

2.1.1 chTNT-3的放射性标记

2.1.2 Raji细胞的化学固定

2.1.3 固定Raji细胞模型的最优条件筛选

2.1.4 固定Raji细胞模型的验证

2.2 包载钙黄绿素的空间稳定免疫脂质体和预定位脂质体的制备

2.2.1 脂质体中钙黄绿素检测方法的建立

2.2.2 钙黄绿素脂质体制备

2.2.3 钙黄绿素脂质体稳定性考察

2.3 空间稳定免疫脂质体和预定位脂质体给药系统的体外靶向性考察

2.3.1.结合试验标准操作

2.3.2.空间稳定免疫脂质体与固定Raji细胞的体外结合试验

2.3.2.1 不同反应时间对结合量的影响

2.3.2.2 不同脂质体量对结合量的影响

2.3.2.3 不同抗体密度对结合量的影响

2.3.2.4 不同粒径对结合量的影响

2.3.3 预定位脂质体与固定Raji细胞的体外结合试验

2.3.3.1 不同作用时间对结合量的影响

2.3.3.2 不同chTNT/B浓度对结合量的影响

2.3.3.3 不同脂质体量对结合量的影响

2.3.3.4 不同生物素取代度对结合量的影响

2.3.4 不同制剂与固定Raji细胞的体外结合试验

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第五章空间稳定免疫脂质体及预定位脂质体给药系统的药动学、药效学与组织分布

1 材料和仪器

1.1 材料

1.2 仪器

1.3 细胞株及实验动物

2 方法与结果

2.1 阿霉素体内分析方法的建立

2.1.1 生物样品的处理

2.1.2 色谱条件

2.1.3 方法专属性

2.1.4 阿霉素体内标准曲线的建立

2.1.5 回收率

2.1.6 精密度

2.2 大鼠体内药物动力学

2.2.1 试验方案

2.2.2 结果及模型拟合

2.3 荷瘤BALA/c-nu/nu裸小鼠模型的建立

2.4 荷瘤BALA/c-nu/nu裸小鼠体内药效学

2.4.1 试验方案

2.4.2 抑瘤率

2.4.3 组织切片

2.5 荷瘤BALA/c-nu/nu裸小鼠体内分布

2.5.1 试验方案

2.5.2 组织分布

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文总结与展望

本课题创新之处

后续研究工作及展望

致谢

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