基于蛋白质组学技术的蚯蚓纤溶酶分析方法研究

论文摘要

蚯蚓纤溶酶（EFE）是从蚯蚓中提取的一组丝氨酸蛋白酶。EFE具有降低血液黏稠度、减少血小板聚集、改善微循环、副作用小的特点,已大量应用于临床,治疗多种血栓性疾病,并取得较好的疗效。中科院生物物理所以赤子爱胜蚓为原料已制成用于预防和治疗血栓的口服胶囊。实际上,该胶囊（蚓激酶粗品）含有多种活性组分。为了便于对蚯蚓纤溶酶药物的生产过程进行质量控制,急需建立一套完整的质控标准方法,为这种药物的生产及开发提供质量保证。通过对EFE的研究现状调查表明,由于各种纤溶酶组分的理化性质比较接近,使分离纯化工作具有很大的挑战性。本研究尝试了利用不同分离方法对蚯蚓纤溶酶粗品中全蛋白组分进行分离,建立了基于强阴离子交换色谱和SDS-PAGE的最佳分析、分离方法。在最佳凝胶电泳分离条件下分离出多达20个蛋白质条带,分别通过MALDI-TOF-MS和2D-LC-MS/MS质谱对各蛋白质条带进行了鉴定。在最佳色谱条件分离出了约35个峰,将其分为26个组分,分别用MALDI-TOF-MS和Q-TOF-MS对各组分中蛋白的分子量进行了准确测定。基于"Shotgun"研究策略的蛋白质组学研究方法,采用了蛋白质数据库和EST（表达序列标签）数据库两种对蚯蚓纤溶酶进行了鉴定：使用蛋白数据库（Lumbricidae sequence）得到20种不同的蛋白；而使用EST形式数据库（Lumbricidae sequence）得到了57种不同的mRNA序列。本研究首次应用蛋白质组学的研究方法对蚯蚓纤溶酶粗品进行分析及鉴定,建立了蚯蚓纤溶酶药物质量控制的一种标准方法,这对开发研究各种新的蛋白药物具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要缩略语
• 第1章 绪论
• 1.1 蚯蚓纤溶酶的研究进展
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究概况
• 1.1.3 赤子爱胜蚓蚯蚓纤溶酶（EFE）的分离及性质
• 1.2 蛋白质组学技术研究概况
• 1.2.1 研究背景
• 1.2.2 蛋白质研究技术
• 1.3 本论文的选题背景、目的及意义
• 第2章 基于凝胶电泳的蚯蚓纤溶酶分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 试剂与溶液配制
• 2.2.3 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 SDS-PAGE分离蚓激酶粗品
• 2.3.2 胶内酶解
• 2.3.3 MALDI-TOF-MS分析
• 2.3.4 LC-LTQ-MS/MS分析
• 2.4 本章小结
• 第3章 基于液相色谱的蚯蚓纤溶酶分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器
• 3.2.2 试剂与溶液配制
• 3.2.3 色谱分离蚓激酶粗品标准方法的建立
• 3.2.4 样品脱盐
• 3.2.5 SDS-PAGE分析所收集的组分
• 3.2.6 MALDI-TOF-MS测定分子量
• 3.2.7 Q-TOF-MS测定分子量
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 色谱分离方法的建立
• 3.3.2 蛋白含量的测定及凝胶电泳分析
• 3.3.3 分子量的测定
• 3.4 本章小结
• 第4章 基于鸟枪法的蚯蚓纤溶酶分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 试剂与溶液配制
• 4.2.3 实验操作方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 蛋白含量测定
• 4.3.2 蚯蚓纤溶酶蛋白质的鉴定
• 4.4 本章小结
• 第5章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢