论文题目: 华根霉产纤溶酶的固态发酵优化及纤溶酶基因的克隆表达
论文类型: 硕士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 迟文鹤
导师: 路福平
关键词: 纤溶酶,华根霉,固态发酵,基因克隆,异源表达
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 血栓栓塞性疾病严重威胁人类生命和健康,溶栓治疗是血栓性疾病安全有效的手段。目前临床使用的溶栓药物疗效肯定,但还存在许多缺陷,而且价格昂贵。因此研制高效、快速、副作用小,价廉的新型溶栓药物的需求迫切。微生物是获得溶栓剂的重要来源。 本论文在以前实验室小型发酵的基础上,对华根霉TK317(Rhizopus chinensis)的固体发酵工艺进行放大和优化,对发酵产物进行了粗提取,结果如下: 在1t固态发酵罐的发酵实验表明,产纤溶酶的最佳条件:初始湿度0.75L/kg含水量,发酵湿度70%,发酵前30h通风量640L/min,30h后通风量变为560L/min,28℃发酵时间60h,酶活力最高,达到706.3U/g物料。运用浸提、超滤浓缩、硫酸铵分级盐析、透析脱盐、冷冻干燥,对纤溶酶进行粗提取。纯化的样品经SDS-PAGE法验证。纤溶酶最终的比活力为134.84U/mg,纯化了27.91倍。 对编码华根霉纤溶酶的基因进行克隆,得到编码该纤溶酶的新基因,并将该基因在大肠杆菌pET表达系统中进行了表达,获得了重组蛋白。 根据已经测得的华根霉纤溶酶蛋白N端氨基酸序列,设计合理的简并性PCR引物。使用Trizol试剂提取华根霉的总RNA,经过RT-PCR,得到大小约为700bp的特异DNA条带,与pUCm-T载体相连,转化E.coli JM109,通过蓝白筛选、酶切鉴定、PCR验证得到转化子,测序,得到编码该酶的基因rcfe。与表达载体pET22b(+)连接,转化E.coli JM109,进行鉴定,提取转化子质粒,电转化E.coli BL21(DE3),通过PCR验证、诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检验,证明华根霉纤溶酶基因获得表达。对重组蛋白进行酶活鉴定,证明重组蛋白没有纤溶酶活性。
论文目录:
1. 前言
1.1 血栓性疾病及治疗方式
1.2 纤溶酶类溶栓剂的现状
1.3 纤溶酶类溶栓剂研究开发状况
1.3.1 重组t-PA的突变体等第三代溶栓制剂
1.3.2 动物来源纤溶酶
1.3.3 植物来源纤溶酶
1.3.4 海洋生物来源纤溶酶
1.3.5 微生物来源纤溶酶
1.4 抗血栓药研究动向
1.5 华根霉纤溶酶的研究进展
1.5.1 华根霉的发酵研究
1.5.2 华根霉纤溶酶的急性毒性及药效学研究
1.5.3 华根霉纤溶酶的研究目标
1.6 研究的主要内容、目的及意义
1.6.1 研究的主要内容
1.6.2 大肠杆菌pET表达系统
1.6.3 研究的意义
2. 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 引物
2.1.3 主要试剂
2.1.4 培养基和溶液
2.1.5 主要仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 华根霉的固态发酵
2.2.2 华根霉产酶曲线的测定
2.2.3 华根霉的总RNA的提取
2.2.4 琼脂糖凝胶电泳
2.2.5 RT-PCR扩增
2.2.6 PCR产物的割胶纯化
2.2.7 重组子质粒的酶切验证
2.2.8 PCR产物的纯化
2.2.9 连接反应
2.2.10 连接产物的电转化
2.2.11 重组子的的筛选
2.2.12 重组子质粒的小量提取
2.2.13 重组子质粒的酶切鉴定
2.2.14 重组子的PCR鉴定
2.2.15 目的基因的测序
2.2.16 载体pET22b(+)的双酶切
2.2.17 酶切片段的割胶纯化
2.2.18 表达载体连接反应
2.2.19 连接产物转化大肠杆菌JM109
2.2.20 表达载体pET22b(+)-rcfe转化大肠杆菌BL21
2.2.21 转化子的诱导表达
2.2.22 转化子质粒的提取
2.2.23 转化子中目的基因的PCR方法检测
2.2.24 SDS-PAGE法鉴定转化子
3. 结果与讨论
3.1 华根霉的固态发酵放大
3.1.1 培养基的含水量和湿度对根霉纤溶酶产量的影响
3.1.2 温度对根霉固态发酵纤溶酶产量的影响
3.1.3 通气量对根霉固态发酵纤溶酶活力的影响
3.1.4 超滤浓缩，硫酸铵分级盐析
3.1.5 纤溶酶纯度的电泳鉴定
3.1.6 纤溶酶的纯化回收
3.2 纤溶酶基因的克隆
3.2.1 出发菌株特性
3.2.2 华根霉总RNA的提取
3.2.3 引物设计
3.2.4 RT-PCR扩增目的基因
3.2.5 RT-PCR产物的单引物验证
3.3 重组质粒pUCm-T-rcfe的构建及转化
3.3.1 重组质粒pUCm-T-rcfe的构建
3.3.2 转化大肠杆菌
3.3.3 重组子的筛选和鉴定
3.4 基因rcfe的序列测定结果
3.5 表达载体pET-22b(+)—rcfe的构建
3.5.1 载体pET-22b(+)的特性
3.5.2 引物设计
3.5.3 表达载体pET-22b(+)—rcfe的构建
3.5.4 表达载体pET-22b(+)—rcfe转化大肠杆菌及重组子的鉴定
3.6 表达载体pET-22b(+)—rcfe转化E.coli BL21
3.6.1 表达载体pET-22b(+)—rcfe电转化E.coli BL21
3.6.2 重组蛋白酶活鉴定
4. 结论与展望
参考文献
致谢
研究生阶段发表论文、申请专利情况
附录
发布时间: 2007-01-10
参考文献
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- [3].华根霉cDNA文库的构建及纤溶酶基因的筛选和功能鉴定[D]. 王盛楠.天津科技大学2009
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