地黄高频再生体系的建立及遗传转化体系的初步研究

论文摘要

地黄是我国著名的传统大宗中药材，为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosaLibosch．）的新鲜或干燥块根。具有清热、滋阴、凉血、生津、补血、益精等功效，和调节免疫功能，改善心血管系统、造血系统及内分泌系统，抗肿瘤，抗衰老及降血糖等药理活性，应用广泛，具有重要的临床价值。由于地黄长期进行无性繁殖，因此，品种退化是地黄生产中存在的主要问题，常规的方法不能对此进行根治。对此，数十年来，不少科研人员在不同层次上作了一些探讨和研究，标明导致地黄品种退化的根本原因是病毒的感染。近年来，我们对河南、山东地黄产区的病毒病原进行了鉴定研究，表明地黄的主要病毒病原为TMV和CMV，并对利用基因工程技术防治地黄病毒病进行了初步探索，但未取得实质性的进展。针对上述情况，我们认为地黄的再生频率不够高、基因转化体系尚不完善是转化失败最主要的两个原因。因此，本文即在前人的工作基础上，进一步优化了以叶片为外植体的再生体系，并在高频再生的条件下建立地黄的遗传转化体系。本论文的主要研究内容和结果如下：1、成功建立并优化了2种地黄再生系统，即愈伤组织再生系统和叶片丛生芽诱导系统。（1）本文应用正交实验优化地黄愈伤组织再生体系。本研究选取L27(313)正交设计表为实验方案，以愈伤组织诱导率、愈伤组织化分级、生长率、生根率、出芽率为指标，运用极差分析、多因素方差分析、多重比较、均值分析等多种统计学手段对以上指标进行分析，评价2，4-D、NAA和6-BA三种植物激素对愈伤组织质量的影响。具体方法为：将叶片分别接种于MS附加不同种类和浓度激素的27组培养基上，进行愈伤组织诱导。暗培养20天后，统计愈伤组织诱导率、愈伤组织化级数、生长率。为了评价不同形态、质地的愈伤组织的分化能力，暗培养后把全部外植体转入分化培养基MS+IAA（0.1 mg／L）+6-BAmg／L（3.0mg／L），光培养30天后统计生根率和出芽率。取得如下结果：①愈伤组织诱导率：6-BA影响显著，NAA、2，4-D影响不显著；当6-BA2.0mg／L时可获得最大愈伤组织诱导率；②愈伤组织化分级：2，4-D和6-BA交互作用影响极显著，单因子6-BA影响显著，而2，4-D和NAA影响不显著；2，4-D 0.1mg／L、6-BA 2.0mg／L时可获得最大愈伤组织化分级；③生根率：2，4-D、6-BA影响极显著，NAA影响不显著；当2，4-D 1.0mg／L、6-BA2.0mg／L时不定根分化最少；④出芽率：2，4-D、NAA及两者的交互作用影响显著，6-BA影响不显著；当2，4-D 0mg／L、NAA 0.5mg／L时出芽率最大；⑤生长率：2，4-D影响极显著，NAA和2，4-D交互作用影响显著；当2，4-D0mg／L和NAA 0.5mg／L时生长率最大。通过以上的分析，确定优化的愈伤组织诱导培养基为MS+NAA（0.5mg／L）+6-BA（2.0mg／L），再生率达90％以上，为地黄再生体系的进一步优化奠定了基础。（2）建立并优化了地黄叶片丛生芽途径：①以MS+6-BA（2、3、4mg／L）+IAA（0.1mg／L）讨论了不同细胞分裂素／生长素比例对地黄叶片再生的影响，以生长率和出芽率为评价指标，经单因素方差分析和均值分析，结果表明MS+6-BA（4mg／L）+IAA（0.1mg／L）即细胞分裂素／生长素40倍比例为优化的叶片丛生芽诱导培养基。②以MS+6-BA（4.0mg／L）+IAA（0.1mg／L）+AgNO3（0、5、10、15、20mg／L）为培养基，讨论AgNO3对地黄叶片及叶主脉丛生芽诱导的影响，以生长率和出芽率为考查指标，经单因素方差分析和均值分析，结果表明叶片的最适硝酸银浓度是5mg／L以下，叶脉在5～10mg／L之间。③以MS+NAA（0.1mg／L）+6-BA（4mg／L）+CH（0、0.5、1、2、3 mg／L）为培养基，讨论水解酪蛋白对地黄叶片丛生芽诱导的影响，实验证明当其浓度高于0.5mg／L时对叶片产生毒害作用，不利于生长和分化。2、初步建立了根癌农杆菌介导的地黄遗传转化体系本研究利用LBA4404／pCAMBIA 1305对地黄的叶盘进行了转化，对转化体系进行了摸索，获得了GUS基因的瞬时表达，初步建立了根癌农杆菌的转化体系。（1）以地黄的生根情况摸索地黄对潮霉素的耐受限度。在MS培养基中添加Hpt（0、2、3、4、5mg／L），通过生根敏感性实验，确定了生根筛选浓度为4mg／L。（2）在叶片丛生芽诱导培养基（MS+6-BA 4.0mg／L+NAA 0.1mg／L）中加入羧苄青霉素，使培养基内所含的Cb浓度分别为0mg／L、200mg／L、300mg／L、400mg／L、500mg／L。以出芽率和生长率为考查指标，说明Cb的添加极大的阻碍了叶片的生长和分化过程。（3）通过观察根癌农杆菌LBA4401在YEB添加200、300、400、500mg／L羧苄青霉素的培养基中的生长情况，测量抑菌圈的大小，确定了最低的抗生素浓度为200mg／L。（4）适当的侵染时间是获得理想转化效果的前提，通过统计GUS基因的瞬时表达率，证明5～10分钟比较适合叶盘的侵染。（5）硝酸银的加入可提高转化叶盘的丛生芽诱导率。（6） AS的加入有利于提高抗性不定芽的诱导率。上述研究完善了怀地黄“85-5”离体培养体系，明确了三种植物激素对地黄叶片再生的影响及可能的机理，并通过农杆菌介导初步建立了地黄的转化体系。这些结果为地黄外源目的基因的转化和品质改良奠定了基础，同时也对药用植物的离体培养和转化研究具有借鉴作用。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 地黄生产中由病毒病引起的退化问题
• 1.1 地黄品种退化的成因
• 1.2 防止地黄品种退化的措施
• 1.3 小结
• 2 植物抗病毒基因工程的研究进展
• 2.1 植物抗病毒基因工程的方法策略
• 2.2 发展趋势及存在的问题
• 2.3 小结
• 3 地黄组织培养的研究进展
• 3.1 地黄离体培养条件
• 3.2 地黄离体培养生物技术在生产中的应用
• 3.3 植物激素在地黄离体再生体系中的作用
• 3.4 探讨地黄离体培养及建立再生体系的几个问题
• 3.5 小结与展望
• 第二章 地黄高频再生系统的建立和优化
• 前言
• 1 愈伤组织再生系统研究
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 结论与讨论
• 2 叶片丛生芽诱导系统研究
• 2.1 分裂素/生长素的比例对叶片丛生芽诱导的影响
• 2.2 硝酸银对地黄丛生芽诱导的影响
• 2.3 水解酪蛋白对愈伤组织分化及叶片丛生芽诱导的影响
• 3 讨论
• 第三章 地黄遗传转化体系的初步研究
• 前言
• 1 材料
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 试剂和酶
• 1.4 用于转化的质粒和工程菌
• 1.5 培养基
• 2 方法
• 2.1 地黄对潮霉素的敏感度试验
• 2.2 羧苄青霉素对地黄叶片丛生芽诱导的影响
• 2.3 羧苄青霉素的抑菌作用
• 2.4 农杆菌Ti质粒转化系统
• 2.5 GUS基因的检测方法
• 3 结果与分析
• 3.1 地黄对潮霉素的敏感度试验
• 3.2 羧苄青霉素对地黄叶片丛生芽诱导过程的影响
• 3.3 羧苄青霉素的抑菌作用
• 3.4 农杆菌中质粒的鉴定
• 3.5 不同培养基对转化的影响
• 3.6 不同侵染时间和浓度对转化的影响
• 3对转化的影响'>3.7 AgNO₃对转化的影响
• 3.8 AS对转化的影响
• 4 结论与讨论
• 4.1 成熟的植株再生系统
• 4.2 适合的植物受体
• 4.3 适当的农杆菌转化条件
• 4.4 适当的添加物
• 第四章 结语
• 参考文献
• 致谢
• 简历
• 图版