缝隙连接蛋白43与大鼠脑水肿相关性研究

论文摘要

脑水肿是继发于脑血管疾病、颅内感染、脑肿瘤及颅脑外伤等多种脑疾病之后出现的病理现象。它不仅可以导致脑细胞（神经元、神经胶质细胞）内环境破坏,引起脑功能障碍,而且可造成颅内高压,影响脑的血液灌流,进一步加重脑组织水肿,甚至形成脑疝而致病人死亡。因此,对于脑水肿的发生机制、诊断和治疗的研究,一直是神经科学重点探讨的课题之一。脑水肿的形成是一个多因素、多环节参与的病理过程,其关键问题是脑细胞膜内外水、电解质分布失衡。近年来的研究发现,无论是血管源性脑水肿还是细胞毒性脑水肿,星形胶质细胞（astrocyte,As）水肿是其最突出的特征,As功能状态的改变可影响到神经元的存活,它对脑水肿有重要影响,它可能是脑水肿发生发展过程中的一个重要因素。因此,对As水、电解质运输调节功能的研究成为人们关注的重点,目前对水通道蛋白4（ aquaporin,AQP4）与脑水肿的关系研究较多,但其具体的调节机制目前尚不清楚。As间及As和神经元、其它胶质细胞间存在广泛的缝隙连接（gap junction ,GJ）,使细胞间进行信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。GJ是由相邻的两个细胞各自胞膜上的缝隙连接半通道对接而成,每个半通道是由6个结构相同的亚单位---连接蛋白形成六聚体结构。缝隙连接蛋白（connexins,Cx）是一个蛋白超家族,目前在哺乳动物中发现的连接蛋白至少有20种,相对分子质量从26～50 kD不等,依分子量的不同而分别命名为Cx32,Cx50,Cx26,Cx43,Cx36等。在哺乳动物脑内,As上主要表达Cx43。Cx43广泛存在于哺乳动物各器官、组织中,其分子结构和功能特点决定了它与机体许多病理生理过程有密切的联系,而Cx43对脑水肿的影响研究甚少,为此,我们设计了本实验。目的:实验采用急性水中毒后脑水肿和脑创伤性脑水肿两种动物模型,在术前2小时向大鼠右侧脑室注射Cx43特异性阻断剂-反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides,ODNs）或等量生理盐水,通过观察大鼠行为学、脑皮层区抗-胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）阳性细胞形态,比较抗-GFAP阳性细胞数量、脑组织比重及脑组织含水量,初步探讨Cx43与脑水肿的相关性。方法:本实验分两部分,第一部分:Cx43与大鼠急性水中毒后脑水肿相关性:健康清洁级Spraque-Dawley（SD）大鼠48只,体重230～250 g,随机分为Cx43阻断剂预处理组和生理盐水对照组。两组急性水中毒后将存活大鼠按脑水肿后处死时间点随机分为3个亚组:20 min,30 min,60 min;每亚组8只,其中5只用做免疫组化,3只用于测脑组织比重。采用大鼠急性水中毒后脑水肿模型,即向大鼠腹腔快速注射蒸馏水（量为20 %体重）和醋酸去氨基加压素（desmopressin acetate, DDAVP）（ 0.4μg/kg）,分别在水中毒后20 min、30 min、60 min对大鼠行为评分、测脑组织比重,抗-GFAP免疫组化标记法观察星形胶质细胞数量和形态变化。第二部分:Cx43与大鼠创伤性脑水肿相关性:健康清洁级SD大鼠50只,体重230～250 g,随机分为Cx43阻断剂预处理组和生理盐水对照组。各组颅脑创伤后存活大鼠按处死时间点15 min、3 h、6 h随机分为3个亚组,每亚组10只,其中5只用于免疫组化染色,另5只用于测定脑组织含水量。采用Feeney’s自由落体硬膜外撞击方法,用20 g砝码于30 cm高处撞击大鼠硬膜上的圆锥上致中型颅脑损伤,分别在脑创伤后15min、3h、6h时用干湿重法测脑组织含水量,用抗-GFAP免疫荧光标记法观察星形胶质细胞数量和形态变化。结果:第一部分:Cx43与大鼠急性水中毒后脑水肿相关性:①生理盐水对照组大鼠行为学评分较ODNs预处理组低（P < 0.05,图5）;②生理盐水对照组细胞较ODNs预处理组细胞肿胀明显,胞体肥大深染,突起粗大（图6 ）;生理盐水较对照组细胞数量较ODNs预处理组细胞数增多明显（P < 0.05,表3）;③生理盐水对照组脑组织比重较ODNs预处理组降低明显（P < 0.05,表5）。第二部分:Cx43与大鼠创伤性脑水肿相关性:①免疫荧光染色,生理盐水对照组细胞肿胀比ODNs预处理组明显,胞体肥大深染,突起粗大（图11）;生理盐水较对照组细胞数量较ODNs预处理组细胞增多明显（P < 0.05,表6）;②脑组织含水量,生理盐水对照组脑组织含水量比ODNs预处理组增多明显（P < 0.05,表7）。结论:术前阻断Cx43可减轻脑水肿程度,推测Cx43参与了脑水肿的形成的病理过程。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 中枢神经系统缝隙连接及缝隙连接蛋白
• 1 缝隙连接的结构
• 2 缝隙连接在胶质细胞中的功能
• 3 缝隙连接在脑损伤中作用的研究进展
• 4 缝隙连接蛋白的结构、类型及分布
• 5 缝隙连接蛋白43的合成与降解
• 6 缝隙连接蛋白43与神经系统疾病
• 第二部分 脑水肿
• 1 脑水肿的概念及分类
• 2 脑水肿的发病机理
• 实验内容
• 一、CX43与大鼠急性水中毒后脑水肿相关性研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 二、CX43与大鼠脑创伤后脑水肿相关性研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 主要经历
• 硕士研究生期间撰写和发表论文题录
• 致谢