论文摘要
【目的】miR-145是针对临床肺腺癌组织标本采用microRNA表达谱芯片检测及定量PCR验证筛选出的一种潜在肺癌“保护性”miRNA。本课题旨在探讨miR-145在体外调控人肺腺癌干细胞（LCSCs）增殖的分子机制,为肺癌防治提供潜在新靶点。【材料与方法】运用miRNA芯片谱进行miRNA表达谱分析;在线生物信息学软件预测miR-145的靶基因,筛选并获取有意义的靶基因,并采用双荧光素酶报告基因方法验证该基因是否为miR-145的靶基因。以人肺腺癌A549细胞株及其富集的LCSCs为研究对象,研究共分成5组:miR-145模拟物组、miR-145阻遏物组、miR-145模拟物阴性对照组、miR-145阻遏物阴性对照组以及空白对照组。采用流式细胞仪及RT-PCR来验证转染效果和各组miR-145的表达情况;检测各组中预测靶基因OCT4的表达水平,运用实时荧光定量PCR和Western Blotting分别在mRNA和蛋白水平测定预测靶基因的表达;进行细胞功能学检测,观察转染后细胞的体外生长情况,CCK-8试验检测细胞增殖活力、Transwell小室检测细胞的侵袭能力、流式细胞仪检测细胞生长周期和LCSCs表型CD133+细胞比例;无血清方法富集LCSCs并进行鉴定,观察LCSCs微球形态并定量分析微球密度及单个微球细胞密度。运用Spass 13.0及GraphPad Prism5.0等软件进行统计结果分析和图表制作。【结果】临床获取的肺腺癌组织标本中miR-145表达较瘤旁正常组织显著下调;miRanda在线生物学预测软件发现OCT4基因是miR-145潜在靶基因;流式细胞仪检测发现miR-145模拟物和阻遏物可高效转染A549细胞株,转染效率达80%以上;进一步的验证发现,miR-145在模拟物和阻遏物转染组的表达具有良好的区分度,表达差异可达十倍以上,而在其它三组中的表达水平未见显著差别;OCT4在mRNA和蛋白水平的表达与miR-145在各组中的表达呈负相关;报告基因检测发现miR-145可作用于OCT4 mRNA的3’UTR区预测靶位;CCK-8试验和流式细胞生长周期检测均表明肺癌A549细胞株在miR-145过表达组的生长明显减缓;Transwell小室试验表明A549细胞体外侵袭能力在miR-145过表达组显著降低;过表达miR-145可显著降低A549细胞株的CD133+细胞比例,并显著抑制肺腺癌干细胞微球的增殖。【结论】本课题证实维持干细胞自我更新的关键基因OCT4是miR-145的靶基因,miR-145可通过下调OCT4基因抑制肺腺癌细胞株的体外生长,并能显著调节LCSCs表型CD133+细胞比例,并显著抑制体外富集的LCSCs微球的增殖,是一种肺癌“保护性”miRNA。