水稻中稻瘟菌丝氨酸蛋白酶MoSp1互作蛋白的功能分析

论文摘要

水稻是世界上三大主粮作物之一,而稻瘟病作为水稻的主要病害每年给全球水稻产业带来巨大损失,如何持久高效的防治稻瘟病成为目前的研究热点。有研究表明,稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶与稻瘟菌的致病性紧密相关。本实验室的前期研究中,利用酵母双杂交的方法筛选出稻瘟病菌丝氨酸蛋白酶MoSp1在水稻中的两个互作蛋白OsMbl1和OsZfp1.生物信息学分析发现,OsMbl1为包含有单子叶植物甘露糖结合凝集素结构域的蛋白,OsZfp1蛋白中含有RING finger结构域,为蛋白质家族zf-C3HC4。目前为止,对植物凝集素的研究主要集中在医学及抗虫转基因工程领域,在植物抗稻瘟病菌方面尚未见报道。另外,目前研究的植物锌指蛋白多为C2H2型,C3HC4型的锌指蛋白亦鲜有研究。本研究通过对稻瘟病菌侵染过程中OsMBL1和OsZFP1基因的表达动态分析发现,OsMBL1基因在稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液接种水稻24h后表达量骤然升高约50倍,随后缓慢下降；而OsZFP1基因在稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液接种水稻后缓慢升高,18h时达到最高峰,约为3.8倍,随后显著降低以至于低于未接种对照组的基础表达水平。在OsMBL1、 OsZFP1过表达植株对稻瘟病菌的抗性分析研究中,我们发现,OsMBL1过表达水稻的抗病能力随着表达量的增加而提高,转OsZFP1基因水稻植株由于样本数量较少该基因表达量与发病指数相关性不明确。研究结果表明,这两个基因在水稻抵抗稻瘟病菌侵染的过程中可能扮演着十分重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1 引言
• 1.1 植物免疫系统
• 1.1.1 病原相关分子模式触发的免疫（PTI）
• 1.1.1.1 病原相关分子模式（PAMPs）
• 1.1.1.2 模式识别受体（PRRs）
• 1.1.1.3 识别后的应答反应
• 1.1.2 效应因子触发的免疫反应（ETI）
• 1.2 稻瘟病菌与丝氨酸蛋白酶
• 1.2.1 稻瘟病菌
• 1.2.2 丝氨酸蛋白酶
• 1.2.3 丝氨酸蛋白酶与真菌致病性的关系
• 1.3 单子叶甘露糖结合凝集素
• 1.3.1 植物凝集素
• 1.3.2 单子叶甘露糖结合凝集素研究进展
• 1.4 锌指蛋白的研究进展
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 水稻
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻的种植
• 2.2.2 稻瘟菌的接种及管理
• 2.2.3 总RNA的制备
• 2.2.3.1 水稻总RNA提取
• 2.2.3.2 稻瘟菌总RNA提取
• 2.2.3.3 RNA纯度检测
• 2.2.3.4 RNA完整性鉴定
• 2.2.4 RT-PCR
• 2.2.5 荧光定量PCR
• 2.2.5.1 SYBR Green法荧光定量PCR
• 2.2.5.2 荧光定量PCR引物设计方法
• 2.2.5.3 最佳退火温度的确定
• 2.2.5.4 荧光定量PCR检测样品的准备
• 2.2.5.5 荧光定量PCR实验设计
• 2.2.5.6 荧光定量PCR反应体系
• 2.2.5.7 荧光定量PCR反应步骤
• 2.2.5.8 荧光定量PCR数据处理方法
• 2.2.6 农杆菌介导的水稻转基因技术
• 2.2.6.1 愈伤组织的诱导
• 2.2.6.2 农杆菌介导水稻愈伤组织转化
• 2.2.6.3 侵染愈伤的脱菌、筛选
• 2.2.6.4 分化
• 2.2.6.5 生根
• 2.2.6.6 移苗
• 2.2.7 转基因水稻处理筛选种植、接种调查
• 2.2.8 转基因水稻叶片微量RNA提取
• 2.2.9 CTAB法提取水稻叶片DNA
• 2.2.10 利用TAIL-PCR进行T-DNA插入位点
• 2.2.10.1 TAIL-PCR原理
• 2.2.10.2 TAIL-PCR的实验设计
• 3 结果与分析
• 3.1 OsMBL1和OsZFP1基因在稻瘟病菌接种后的表达动态
• 3.1.1 OsMBL1和OsZFP1基因在稻瘟病菌接种后不同时间段的表达动态
• 3.1.2 OsMBL1和OsZFP1基因对稻瘟病菌非亲和菌株和亲和菌株的应答分析
• 3.1.3 小结与讨论
• 3.1.3.1 OsMBL1基因的表达与稻瘟菌附着胞形成及侵染过程紧密相关
• 3.1.3.2 水稻中OsZFP1基因功能较为复杂
• 3.2 OsMBL1、OsZFP1基因过表达植株的抗病鉴定
• 3.2.1 农杆菌介导的转基因水稻培育
• 3.2.2 OsMBL1、OsZFP1基因过表达水稻T1代植株的抗病性调查
• 3.2.2.1 OsMBL1基因过表达水稻潮霉素筛选调查
• 3.2.2.2 OsZFP1基因过表达水稻潮霉素筛选调查
• 3.2.2.3 OsMBL1和OsZFP1基因过表达水稻植株的抗病鉴定
• 3.2.3 OsMBL1、OsZFP1基因过表达植株中目的基因相对表达量的检测
• 3.2.3.1 OsMBL1基因过表达植株中目的基因的检测
• 3.2.3.2 OsZFP1基因过表达植株中目的基因的检测
• 3.2.4 利用TAIL-PCR进行T-DNA插入位点
• 3.2.5 小结与讨论
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 附录
• 附录1：水稻组培培养基配方
• 附录2：试剂配制
• 附录3：病斑分级标准
• 附录4：水稻叶片总RNA的提取和检测中主要试剂及仪器的处理
• 附录5：RT-PCR
• 附录6：荧光定量PCR图谱
• 附录7：TAIL-PCR程序及引物序列
• 致谢