沙眼衣原体CT703蛋白在感染细胞中的表达及功能初探

论文摘要

一、研究目的1.研究CT703蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的表达模式、持续性感染状态下CT703蛋白的表达变化。2.研究CT703蛋白对Raf/MEK/ERK信号通路的激活及抗凋亡作用。二、研究方法1.RT-PCR法扩增沙眼衣原体L2血清型CT703基因全长序列并亚克隆到原核表达质粒pGEX-6p-1中。2.IPTG诱导重组质粒pGEX-6p-1/CT703在大肠杆菌BL21中表达相应的重组融合蛋白,利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化重组融合蛋白,以纯化的重组融合蛋白作为免疫原免疫小鼠制备抗CT703蛋白多克隆抗体。3.采用Western Blot和免疫荧光技术,以抗CT703蛋白多克隆抗体为一抗检测CT703蛋白在沙眼衣原体急性感染状态下的表达模式。4.采用RT-PCR和Western Blot技术分别检测在干扰素-γ诱导沙眼衣原体持续性感染状态下CT703mRNA和蛋白水平表达变化。5.构建CT703基因真核表达重组质粒pcDNA4/CT703并转染HeLa细胞,Western Blot技术检测CT703蛋白是否活化Raf/MEK/ERK信号通路；并检测转染细胞在十字孢碱（Staurosporine, STS）作用下,细胞凋亡率以及Caspase-3活性变化。三、研究结果1.利用RT-PCR技术扩增沙眼衣原体L2血清型CT703基因,扩增片段长度约1.5kb,与预期理论值大小一致。重组质粒pGEX-6p-1/CT703经EcoR I和NotⅠ双酶切后,约在1.5kb处同样出现特异性DNA条带。通过DNA测序,证实插入的基因序列与GenBank公布的CT703基因序列完全一致,表明重组质粒构建成功。2.原核表达重组质粒pGEX-6p-1/CT703经IPTG在大肠杆菌BL21中诱导表达,纯化产物经考马斯亮蓝染色显示产物分子量约81kDa,由55KDa的CT703蛋白和26KDa的GST蛋白组成,与预期理论的分子量大小一致。以抗GST蛋白抗体为一抗,Western Blot技术检测纯化的重组融合蛋白,在81KDa处检测到相应的蛋白条带。Werstern Blot实验证实以重组融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能与CT703蛋白特异性结合；间接ELISA法检测抗血清效价,结果显示抗体滴度最高达到1：32000。3.利用Western Blot技术检测CT703蛋白在沙眼衣原体急性感染状态下的表达,感染后24小时可检测到相应的蛋白,随着感染时间的延长,蛋白表达量逐渐增多,并持续存在于整个感染过程,未感染细胞组没有检测到CT703蛋白的表达；通过免疫荧光技术检测CT703蛋白表达,最早在感染12小时即可检测到相应的蛋白。在干扰素-γ诱导沙眼衣原体持续性感染状态下,RT-PCR和Western Blot技术检测CT703 mRNA和蛋白的表达情况,结果表明持续性感染状态下CT703 mRNA和蛋白表达不呈时间依赖性,相同时间点沙眼衣原体持续性感染状态下CT703 mRNA和蛋白水平明显低于急性感染状态。4.间接免疫荧光技术对内源性的CT703蛋白进行定位,结果显示沙眼衣原体感染细胞CT703蛋白的荧光染色部位既不同于胞浆蛋白CPAF,也不同于包涵体膜蛋白CT813。5.构建的真核表达重组质粒pcDNA4/CT703经PCR、双酶切实验证实插入片段大小与CT703基因片段大小一致,测序证实插入的基因序列与GenBank公布的CT703基因序列完全一致。重组质粒pcDNA4/CT703转染到HeLa细胞后,Western Blot和免疫荧光实验均能检测到CT703蛋白的表达。6.真核表达重组质粒pcDNA4/CT703转染HeLa细胞后36小时检测磷酸化的Raf、ERK,发现二者均未被磷酸化；转染质粒36小时后,STS诱导细胞凋亡5小时,用流式细胞术检测细胞凋亡率以及用Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活性。同时设STS诱导的HeLa细胞组、STS诱导的沙眼衣原体感染组和正常HeLa细胞组作为对照,发现4组细胞的凋亡率分别为：（93.1±2.01）%、（91.3±1.67）%、（3.21±0.87）%、（2.08±0.76）%。统计学分析,STS诱导的重组质粒转染组与正常HeLa细胞组比较有显著性差异,与STS诱导的衣原体感染组比较有显著性差异（P<0.05）,与STS诱导的HeLa细胞组比较没有显著性差异（P>0.05）。Caspase-3活性检测结果与细胞凋亡率一致。四、结论1.成功构建原核表达重组质粒pGEX-6p-1/CT703以及真核表达重组质粒pcDNA4/CT703。2.沙眼衣原体急性感染状态下CT703蛋白表达呈时间依赖性增加,持续性感染状态下CT703蛋白表达不呈时间依赖性；相同时间点沙眼衣原体持续性感染状态下CT703蛋白表达明显低于急性感染状态。3.CT703蛋白不能激活Raf/MEK/ERK信号通路,不能抑制STS诱导的细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词简表
• 前言
• 第一章 沙眼衣原体CT703蛋白表达及多克隆抗体制备
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 沙眼衣原体L2血清型成功感染HeLa细胞
• 1.2.2 抽提的RNA完整性较好
• 1.2.3 RT-PCR扩增产物与全长CT703基因大小一致
• 1.2.4 成功构建pGEX-6p-1/CT703原核表达重组质粒
• 1.2.5 GST-CT703融合蛋白的表达与纯化
• 1.2.6 蛋白质标准曲线
• 1.2.7 成功制备特异性的抗CT703蛋白多克隆抗体
• 1.2.8 抗CT703蛋白多克隆抗体效价检测
• 1.3 讨论
• 1.4 结论
• 第二章 沙眼衣原体CT703蛋白在感染细胞中的表达研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 主要仪器
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.1.3 细胞与菌株
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 CT703蛋白与衣原体MOMP蛋白荧光染色发生重叠
• 2.2.2 沙眼衣原体急性感染状态下CT703蛋白表达呈时间依赖性增加
• 2.2.3 沙眼衣原体急性感染和持续性感染模型建立成功
• 2.2.4 沙眼衣原体持续性感染时CT703基因表达下调
• 2.2.5 沙眼衣原体持续性感染状态下CT703蛋白表达下调
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 沙眼衣原体CT703蛋白抗凋亡作用的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 成功构建真核表达重组质粒pcDNA4/CT703
• 3.2.2 真核表达重组质粒pcDNA4/CT703在HeLa细胞中的表达
• 3.2.3 CT703蛋白不能激活Raf/MEK/ERK信号通路
• 3.2.4 CT703蛋白不能抑制STS诱导的细胞凋亡
• 3.2.5 CT703蛋白不能抑制STS诱导的Caspase-3激活
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 总结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果目录