大豆疫霉菌和寄生疫霉菌中小RNA的初步鉴定和分析

论文摘要

真核生物编码的小分子非编码RNA是一类重要的转录后调控因子,包括动植物中普遍存在的microRNA,siRNA,以及在哺乳动物生殖细胞中发现的piRNA等。病原卵菌是一类形态上与真菌相似,但进化上相距甚远的真核微生物,给农业生产和生态系统造成巨大的损失和破坏。小RNA分子因其普遍存在,并且具有重要的调控功能而倍受关注,然而在卵菌中至今还未见到相关小RNA的报道。本研究采用大豆疫霉菌和寄生疫霉菌作为植物病原卵菌的模式生物,通过构建小RNA文库并对其进行高通量测序,结果分析表明:大豆疫霉和寄生疫霉小RNA分子均在25nt处有峰值分布,意味着疫霉菌中可能存在相应的核酸酶加工特定大小的小RNA分子;大豆疫霉菌小RNA分子在基因组上的分布存在着显著的差异,有明显的小RNA转录热点和非转录区域存在,为疫霉菌中小RNA分子的存在及识别提供了证据;通过对大豆疫霉菌小RNA分子分类表明,疫霉菌中存在种类极其丰富的非编码小RNA分子;通过计算机预测和Northern验证,初步确定了疫霉菌中的一些tRNA和rRNA来源的小RNA分子;传统实验克隆也表明疫霉菌中有tRNA和rRNA来源的小RNA富集;对大豆疫霉菌和寄生疫霉菌tRNA来源的小RNA分子Pso4367和Ppa10815的表达模式分析表明其均在菌丝、孢子囊和卵孢子中高表达,侵染组织次之,休止孢和萌发的休止孢表达量均很低。本研究对大豆疫霉菌和寄生疫霉菌的小RNA进行初步的鉴定和分析,探索了卵菌小RNA分子的特征及种类,并识别验证了疫霉菌若干小RNA分子候选,为研究卵菌的小RNA生物学鉴定了基础,有助于了解其在卵菌和/或植物与卵菌互作中的功能,为卵菌病害的防治提供新的途径和方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 寄生疫霉菌和大豆疫霉菌
• 1.1.1 寄生疫霉菌
• 1.1.2 大豆疫霉菌
• 1.2 小RNA 研究概述
• 1.2.1 miRNA
• 1.2.2 siRNA
• 1.2.3 piRNA
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 大豆疫霉菌，寄生疫霉菌小RNA 文库的构建及分析
• 2.1 实验材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试剂
• 2.2 寄生疫霉菌和大豆疫霉菌各个时期材料的收集
• 2.2.1 寄生疫霉菌各个时期材料的收集
• 2.2.2 大豆疫霉菌各个时期材料的收集
• 2.2.3 寄生疫霉菌侵染拟南芥叶片组织的制备
• 2.3 各种组织RNA 的提取
• 2.4 寄生疫霉菌和大豆疫霉菌小RNA 的测序
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 总RNA 的提取
• 2.5.2 寄生疫霉菌和大豆疫霉菌小RNA 的分布分析
• 2.5.3 高质量序列的分类
• 2.5.4 疫霉菌中microRNA 的预测
• 2.6 讨论
• 第三章 小RNA 的实验克隆
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 接头及引物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 低分子量RNA 的分离
• 3.2.2 Small RNA 的分离
• 3.2.3 Small RNA 的去磷酸化
• 3.2.4 3’接头的连接
• 3.2.5 加接头的小RNA 的5’磷酸化及与5’接头的连接
• 3.2.6 Small RNA 连接产物的反转录
• 3.2.7 反转录产物PCR
• 3.2.8 PCR 产物加A
• 3.2.9 PCR 产物与pGXT 载体连接
• 3.2.10 电击转化
• 3.3 AppDNA adaptor 的合成
• 3.3.1 ImpA（adenosine-5’-phosphoimidazolide）的合成
• 3.3.2 3’adaptor 的腺苷酰化修饰
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 总RNA 提取及低分子量RNA 的分离
• 3.4.2 Small RNA 的分离
• 3.4.3 Small RNA 加3’接头后的分离
• 3.4.4 Small RNA 加5’接头后的分离
• 3.4.5 反转录产物PCR 后检测
• 3.4.6 测序结果
• 3.5 讨论
• 第四章 大豆疫霉菌和寄生疫霉菌中候选小 RNA 的验证
• 4.1 实验材料及试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 总RNA 的电泳及转膜
• 4.2.2 Northern blot
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 tRNA 来源的小RNA
• 4.3.2 rRNA 来源及其他来源的小RNA
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介