抗AT1受体细胞外第二环肽段抗体参与动脉粥样硬化发病的机制研究

论文摘要

第一部分兔抗人AT1受体细胞外第二环肽抗体的制备提纯及鉴定目的：利用人工合成的AT1受体细胞外第二环肽段免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,提纯并对其生物学活性进行鉴定。以期了解抗AT1受体自身抗体在动脉粥样硬化发病机制中的作用,从自身免疫角度对该病的诊治提供指导。方法及结果：根据人AT1受体细胞外第二环肽段氨基酸序列,人工合成多肽,用化学方法与载体牛血清白蛋白（BSA）偶联,免疫新西兰大白兔,ELISA法检测抗体滴度,合成的肽段有良好的免疫原性,在接受第二次免疫后一周兔体内抗体开始升高,第五次免疫后一周ELISA检测抗体反应效价达到峰值1：409600,收获兔抗血清。免疫亲和层析法提纯抗血清,SDS-PAGE法鉴定纯化后抗体的纯度呈单一清晰蛋白带；Western blot方法检测结果显示,制备的抗AT1受体抗体与AT1受体蛋白在分子量40KD处结合,形成唯一显色带,与AT1受体蛋白分子量一致；细胞免疫荧光法检测观察到制备的抗体在细胞膜表面与AT1受体结合,与AT1受体是膜受体的细胞定位结果一致。结论：所制备的兔抗人多克隆抗体可特异性识别AT1受体,为后续针对该抗体细胞分子水平实验研究打下良好基础。第二部分抗AT1受体细胞外第二环肽段抗体对人脐静脉内皮细胞表达MCP-1的影响及相关信号传导机制研究目的：研究制备的兔抗人AT1受体细胞外第二环肽段抗体（AT1-AA）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达MCP-1（单核细胞趋化因子-1）的影响及相关信号机制。从细胞蛋白、分子水平探讨AT1-AA对内皮细胞炎症因子表达的影响以明确它们在动脉粥样硬化（AS）发生发展中的地位和相互关系,以及AT1受体拮抗剂可能的抗AS作用。方法及结果：将AT1-AA与HUVECs共孵育,设不同的稀释度和孵育时间点检测MCP-1的表达,取MCP-1表达量最大的1：20稀释,与HUVECs共孵育12小时。用Western blot和PT-PCR方法检测细胞MCP-1蛋白和mRNA表达。结果显示：与抗体阴性组比较AT1-AA与HUVECs共孵育后MCP-1蛋白和mRNA表达明显增高,氯沙坦可显著抑制AT1-AA诱导的内皮细胞MCP-1表达。PDTC（吡咯二硫氨基甲酸脂）是NF-κB P65特异性抑制剂,用不同浓PDTC（5, 10,20μmol/L）预处理内皮细胞1小时后,加1：20稀释的AT1-AA作用HUVECs 12h收获细胞,用Western blot:和：PT-PCR方法检测细胞MCP-1和P65蛋白及mRNA表达量变化,以不加PDTC组为对照。结果显示：与对照组比较,PDTC干预组随着PDTC浓度升高,MCP-1蛋白和：mRNA表达量均降低（P<0.05）,P65蛋白和mRNA表达量也降低（P<0.05）。直线相关分析显示,MCP-1表达水平与PDTC浓度呈显著负相关,P65表达水平与PDTC浓度呈显著负相关,提示PDTC呈浓度依赖性下调MCP-1的表达,同时下调P65的表达。结论：AT1-AA可通过NF-κB途径,上调内皮细胞下游靶基因（炎症因子MCP-1）表达促进单核细胞粘附内皮,可能是AT1受体自身抗体参与动脉粥样硬化发生发展的机制之一。第三部分抗AT1受体细胞外第二环肽段抗体对THP-1源性泡沫细胞表达ABCA1影响的实验研究目的：通过研究AT1-AA对THP-1源性泡沫细胞表达ABCA1（ATP结合盒转运蛋白A1）的影响,从细胞蛋白、分子水平探讨AT1-AA对泡沫细胞脂质转移受体表达的影响,以期明确其在动脉粥样硬化发生发展中的地位和相互关系以及AT1受体拮抗剂可能的抗AS作用。方法及结果：将THP-1单核细胞用PMA诱导分化成贴壁的巨噬细胞,给予ox-LDL脂负荷,诱导其成为泡沫细胞细胞,显微镜下观察可见细胞形态不规则,融合,胞浆内有颗粒状物,油红O染色见细胞内大量脂滴,酶荧光化学法检测细胞内含大量胆固醇,显示构建泡沫细胞模型成功。将AT1-AA与泡沫细胞共孵育,Western blot和PT-PCR方法检测细胞ABCA1的表达1nRNA和蛋白表达。结果显示：与对照组相比AT1-AA显著抑制ABCA1蛋白和1mRNA的表达,血管紧张素Ⅱ组相比无显著差异,氯沙坦能显著减轻AT1-AA对ABCA1蛋白和mRNA表达的抑制作用,但表达量仍显著低于阴性对照组。结论：AT1-AA下调THP-1源性泡沫细胞表达ABCAl,阻碍细胞内胆固醇的流出,可能是AT1受体自身抗体参与动脉粥样硬化发生发展的机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 兔抗人AT1受体细胞外第二环肽段抗体的制备提纯及鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二部分 抗AT1受体细胞外第二环肽段抗体对人脐静脉内皮细胞表达MCP-1的影响及相关信号传导机制研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第三部分 抗AT1受体细胞外第二环肽段抗体对THP-1源性巨噬细胞表达ABCA1影响的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 综述 抗AT1受体细胞外第二环肽段抗体参与动脉粥样硬化的机制
• 参考文献
• 附录
• 致谢