LMW RNA分离方法改进及与人类胚胎发育相关miRNA的克隆表达

论文摘要

microRNA（miRNA）是一组不编码蛋白质的短序列RNA。研究预测，它调节着人类三分之一的基因。miRNA具有长度短、丰度低的特点，因此必须使用一套专门适合miRNA的克隆方法。国内比较有代表性的是中山大学屈良鹄教授设计的末端转移酶加长法和解放军医学院郑晓飞教授设计的逆转录加尾法。本实验在逆转录加尾法的基础上，对于LMW RNA的分离富集方法进行了改进。利用PEG的分子特点，改变其浓度与沉淀时间，成功地从总RNA中分离富集了LMW RNA。MicroRNA对于胚胎发育尤其是胚胎的早期发育有非常重要的意义。在线虫等生物中已经发现并鉴定了与胚胎发育及其细胞分化相关的miRNA。本文选取了45d，55d，90d的早期胚胎以及脐带血作为研究对象，从中克隆得到了8条短序列RNA。经过BLAST比对和二级结构分析，发现其中一条具有miRNA的结构特征，暂时命名为miR-X1。经过半定量PCR检测其可以真实表达，确认此序列为候选miRNA，但还需要经过Northernblot进一步确认其为miRNA。经过生物信息学分析，此序列位于人类基因组第4条染色体中p16.3印迹区的基因内含子中，附近没有已发现的miRNA，说明miR-X1可能为单独表达。邻近编码蛋白质基因中没有能够找到miR-X1的靶基因。通过半定量PCR法分析此miRNA在不同发育阶段中的表达情况，发现其在45d，55d的早期胚胎及其脐带血中高度表达，预测此miRNA可能与发育调节及细胞分化有关。为寻找与人类胚胎发育及其细胞分化的关键miRNA做出了一定贡献。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 microRNA简介
• 1.1.1 miRNA的生物功能与研究意义
• 1.1.2 miRNA,siRNA及其RNAi
• 1.2 miRNA的研究策略与研究进展
• 1.2.1 miRNA的特征与miRNA的鉴定策略
• 1.2.2 MiRNA基因的寻找
• 1.2.3 MiRNA的作用机制及其靶基因的预测
• 1.2.4 miRNA表达分析
• 1.3 与胚胎发育相关的miRNA的研究意义
• 1.4 研究思路
• 1.4.1 LMW RNA分离方法改进的技术路线
• 1.4.2 miRNA克隆表达的技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种及载体
• 2.2.2 培养基及其细菌培养用试剂
• 2.2.3 分子生物学实验用试剂
• 2.2.4 试剂盒
• 2.2.5 其他试剂
• 2.2.6 RNA适配子（adapter）及其引物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 总RNA提取
• 2.3.2 切胶回收法分离LMW RNA
• 2.3.3 FLASHPAGE Fractionator法分离LMW RNA（富集<40nt RNA）
• 2.3.4 PEG LMW RNA分离法
• 2.3.5 LMW RNA加尾
• 2.3.6 LMW RNA加5’adapter
• 2.3.7 cDNA合成
• 2.3.8 PCR扩增cDNA片断
• 2.3.9 PCR产物回收
• 2.3.10 制备感受态细胞
• 2.3.11 PCR产物的连接
• 2.3.12 转化
• 2.3.13 电泳鉴定阳性克隆
• 2.3.14 序列测定
• 2.3.15 miRNA的鉴定
• 2.3.16 miRNA的功能预测
• 2.3.17 半定量PCR法检测miRNA在各组织中的表达情况
• 第三章 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 分离LMWRNA
• 3.2.1 不同的分离方法分离LMW RNA
• 3.2.2 以不同材料分离LMW RNA
• 3.3 miRNA的克隆
• 3.4 序列前体预测及其二级结构分析
• 3.4.1 序列1前体序列预测与二级结构分析
• 3.4.2 序列3前体序列预测与二级结构分析
• 3.4.3 序列4前体序列预测与二级结构分析
• 3.4.4 序列6前体序列预测与二级结构分析
• 3.4.5 序列7前体序列预测与二级结构分析
• 3.4.6 序列8前体序列预测与二级结构分析
• 3.4.7 总结
• 3.5 其它生物信息学分析
• 3.5.1 序列1在miRNA库中进行比对
• 3.5.2 序列1基因组中定位
• 3.5.3 序列1与在胚胎干细胞进行比对
• 3.5.4 序列1与成人血液中的miRNA比对
• 3.5.5 序列1与已确定功能的miRNA比对
• 3.6 miRNA的表达分析
• 3.6.1 半定量PCR法可行性分析
• 3.6.2 miRNA在8种细胞中的表达
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录