香猪卵巢细胞生物学特性和影响母猪卵巢颗粒细胞体外成熟的因素探讨

论文摘要

卵巢卵泡发育是个十分复杂的过程,经历卵泡发育的启始、募集、选择、优势化、排卵和黄体化等过程。同时,卵泡的生长和发育也是一个高度协调的生理过程,受多种因素（激素、生长因子、芳香化酶、金属离子、物理及化学刺激等）的影响和控制,少数卵泡最终发育为优势卵泡并排卵,99%以上的卵泡都将发生闭锁。香猪是我国特有的小型猪种之一,也医学和繁殖学的理想模式动物。但与其繁殖相关的细胞生物学知识研究很少。哺乳动物中,叉头转录因子家族O亚家族的4个成员:FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6在多种生命活动中起着广泛的作用。近年来的研究表明,FoxO转录因子在小鼠、大鼠、人的卵巢中通过多条通路调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡。深入研究香猪卵巢细胞的生物学特性及FoxO蛋白在卵泡发育及发情周期中的作用及其调控机制,在提高家畜繁殖力、人的不孕症治疗、避孕手段的开发以及癌症等疾病的防治等方面均具有重要意义。本实验采用TUNEL法检测了香猪卵巢中的细胞凋亡,利用免疫组织化学的方法就FoxOs及几个相关蛋白在香猪卵巢中的细胞定位进行了研究,利用流式细胞术、RIA、Western blot等方法检测了不同直径猪卵泡中的颗粒细胞和不同处理条件下的体外培养的猪颗粒细胞的存活率、[Ca2+]i、E2的分泌以及FoxO3a、Bcl-2的表达水平,就其可能的作用机制进行了深入探讨。主要结论如下:1.用TUNEL法检测香猪卵巢中的细胞凋亡的结果表明:健康卵泡中颗粒细胞排列整齐,仅在靠近卵泡腔处有少量颗粒细胞发生凋亡,而在闭锁卵泡中,颗粒细胞排列松散,部分进入卵泡腔,且凋亡比例较高。香猪卵巢切片的免疫组织化学检测结果表明:抑制素α在发育各阶段卵泡的颗粒细胞细胞质中有表达;PKB在香猪卵巢原始卵泡的颗粒细胞、次级卵泡和有腔卵泡的近卵泡膜细胞的颗粒细胞内有表达,在闭锁卵泡、黄体和卵巢间质细胞中均不表达;FoxO1在原始卵泡、次级卵泡、有腔卵泡的颗粒细胞的细胞质中有表达,在闭锁卵泡中凋亡颗粒细胞及黄体细胞中没有表达;FoxO3a在发育各阶段卵泡的颗粒细胞、颗粒黄体细胞以及血管内皮细胞的细胞质中均有表达;FoxO1和FoxO3a均在卵母细胞中表达;未检测到FoxO4在香猪卵巢细胞中的表达;Bax和Bcl-2在各发育阶段卵泡的颗粒细胞、黄体细胞和血管内皮细胞中均有表达。表明抑制素α、PKB、FoxOs、Bax和Bcl-2在香猪卵巢中呈卵泡发育阶段特异性和细胞特异性表达,可能在香猪卵泡的发育、闭锁和黄体化中起重要调控作用。2.为了研究FoxO6在猪生殖系统的作用,本实验从4个成年猪卵巢和4只成年小鼠的脑组织中提取RNA,根据已报道的小鼠Foxo6基因引物进行RT-PCR,结果从小鼠脑组织中扩增出一条约2500 bp的片段,而猪卵巢组织中未见此片段。因此,FoxO6基因可能在成年猪卵巢中不表达。3.为了研究猪卵泡发育过程中影响pGC生长和卵泡闭锁的因素,本实验中用机械法从猪卵巢分离有腔卵泡,按直径大小分为3组:小卵泡（1.5-3 mm）、中卵泡（3-5mm）和大卵泡（≧5 mm）,统计健康卵泡和闭锁卵泡分别所占比率,分离pGC并收集pFF。用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测pGC存活率和Fluo 3-AM探针标记pGC检测[Ca2+]i,用Western blot检测pGC内FoxO3a表达水平,用化学发光法检测pFF中E2的浓度。结果表明:随有腔卵泡直径的增大,闭锁卵泡的比率逐渐降低（P<0.05）,健康卵泡的比率逐渐增加（P<0.05）;pGC存活率逐渐升高（P<0.05）;pGC内[Ca2+]i逐渐降低（P>0.05）;pGC内FoxO3a表达水平逐渐升高（P<0.05）;pFF中E2的浓度逐渐升高（P<0.05）。表明[Ca2+]i和FoxO3a转录因子可能通过调控不同直径有腔卵泡中pGC的生长和凋亡,从而调节猪有腔卵泡的生长、发育和闭锁。4.为研究细胞外游离Ca2+对pGC的影响,在猪颗粒细胞培养液中添加CaCl2或Ca2+螯合剂EGTA,分别于0h、6h、24h和48h收集pGC和培养液。用流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)、用Western blot检测pGC内FoxO3a表达水平、用RIA法检测培养液中E2的浓度。结果表明:（1）培养液中50 mg/mL CaCl2对pGC的[Ca2+]i没有显著影响;50μg/mL EGTA显著降低了猪颗粒细胞内Ca2+浓度（P<0.05）,但500μg/mL EGTA反而对PGC的[Ca2+]i无显著影响。（2）培养液中添加CaCl26h可以显著提高pGC内FoxO3a的表达,而添加EGTA显著抑制了pGC内FoxO3a的表达（P<0.05）,且抑制程度呈剂量依赖性关系。（3）培养液中添加CaCl2对pGC内E2的分泌起抑制作用,而添加EGTA对pGC内E2的分泌起显著的促进作用（P<0.05）,且E2分泌提高幅度与EGTA的添加量呈剂量依赖性正相关。另外,体外培养的pGC中E2的分泌随时间的延长逐渐升高的趋势,体外培养的pGC可能存在一个自成熟的过程。所以,细胞外钙离子可能通过FoxO3a信号通路来调控体外培养的pGC的生长、凋亡和成熟。5.为研究pGC中Ca2+信号通路是否受PI3K/PKB/FoxO信号通路的调节,用2ng/mL FSH、1mmol/L EGTA(一种Ca2+螯合剂)、10μmol/L LY294002（一种PI3K的特异性抑制剂）以及FSH+EGTA、EGTA+LY和FSH+EGTA+LY共处理体外培养的pGC,用流式细胞仪检测pGC存活率、用Western blot检测pGC内FoxO3a等蛋白表达水平、用RIA法检测培养液中E2的浓度。结果表明:处理后2h,各处理组细胞存活率差异不显著,E2分泌量差异不显著;处理后6h,EGTA和LY294002共处理组细胞存活率显著降低（P＜0.05）,其他各组细胞存活率差异不显著（P＞0.05）,EGTA处理组FoxO3a的表达水平受抑制,而LY294002处理组pGC内FoxO3a的表达水平升高,FSH对pGC中Bcl-2的表达起促进作用,而EGTA起抑制作用,添加LY促进了Bcl-2的表达;处理后24 h,LY294002+EGTA处理组和LY294002+EGTA+FSH共处理E2的分泌量显著降低（P＜0.05）。所以,pGC内Ca2+信号通路与FoxO蛋白所在的PI3K/PKB信号通路存在交互作用,可能在pGC的成熟过程中起调控作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 前言
• 文献综述
• 第一章 FOXO转录因子的研究进展
• 1 FOXO转录因子的命名和结构
• 1.1 FOXO转录因子的命名
• 1.2 FOXO转录因子的结构
• 2 FOXO转录因子的调节
• 2.1 FOXO转录因子的磷酸化
• 2.2 FOXO转录因子的乙酰化
• 2.3 FOXO转录因子的泛素化
• 3 FOXO转录因子的功能
• 3.1 FOXO蛋白调控细胞的增殖、分化和凋亡
• 3.2 FOXO蛋白与疾病发生
• 3.3 FoxO蛋白与繁殖
• 3.4 FoxO转录因子与细胞的衰老和应激
• 4 FOXO转录因子研究中存在的问题及未来研究方向
• 5 参考文献
• 第二章 母猪的繁殖生理及影响因素
• 1 种母猪的繁殖周期
• 2 我国的地方猪种—香猪
• 2.1 香猪概述
• 2.2 香猪的生长发育的研究
• 2.3 香猪的生殖生理与繁殖性能的研究
• 3 卵泡发育及调控机理
• 3.1 卵泡发育及影响因素
• 3.2 卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡
• 4 细胞凋亡检测方法
• 4.1 形态学观察
• 4.2 DNA电泳
• 4.3 彗星电泳法
• 4.4 TUNEL测定法
• 4.5 流式细胞术
• 5 参考文献
• 试验研究
• 第三章 抑制素α、PKB、FoxOs、Bax和Bcl-2蛋白在香猪卵巢中的表达定位
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第四章 猪卵巢FoxO6基因的检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第五章 不同直径猪卵泡中FoxO3a转录因子和细胞内钙离子对颗粒细胞的调节
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第六章 细胞外钙离子对体外培养的猪卵巢颗粒细胞的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第七章 钙离子对体外培养的猪卵巢颗粒细胞的影响途径的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 全文结论
• 创新点
• 附录 主要溶液的配制
• 攻读博士期间发表及待发表的论文
• 致谢