红色红曲菌G蛋白β与γ亚基基因功能的初步研究

论文摘要

红曲菌是我国传统发酵制品——红曲的生长菌种,可以产生多种有益代谢产物,被广泛应用于食品和医药领域中,但是大多数红曲菌也可以产生真菌毒素——桔霉素,从而引发了人们对红曲安全性的争议。为了有效地控制红曲中桔霉素的含量,开展红曲菌代谢产物调节系统的研究是很有必要的。异源三聚体G蛋白（Ga,Gβ和Gγ）介导的信号转导途径普遍存在于丝状真菌中,并对丝状真菌的营养生长,繁殖和次级代谢产物的合成具有重要的调控作用。其中,Gβ和Gγ常以二聚体（Gβγ）形式存在。在前期研究中,本实验室已经得到了红色红曲菌M-7中Gβ编码基因Mgbl和Gγ编码基因Mggl的全长序列,本课题将在此基础上,采用基因敲除和过表达两种技术对Mgbl和Mggl基因的功能进行分析研究,以期为红曲菌主要代谢产物调控体系的研究提供基础。主要研究内容与结果如下：1.红色红曲菌M-7 Mgbl和Mggl基因的分析采用softberry预测Mgbl和Mggl的基因结构和编码氨基酸序列。其中,Mgbl基因的开放读码框包含5个外显子和4个内含子,编码353个氨基酸；Mgg1基因的开放读码框包含3个外显子和2个内含子,编码94个氨基酸。Blastp结果表明,Mgbl和Mgg1编码的氨基酸与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）同源性最高,分别达到96%和87%。2.Mgb1和Mgg1基因敲除突变子的构建分别以潮霉素抗性基因（hph）和新霉素抗性基因（neoR）为筛选标记,构建Mgb1和Mgg1的同源重组敲除载体,采用农杆菌介导的转化方法转化出发菌株M-7,经PCR筛选和Southern杂交验证得到三株Mgbl缺失突变子（ΔMgb1-4,7,23）和三株Mgg1缺失突变子（ΔMggl-1,13,17）；在此基础上,以Mgg1缺失突变子为转化受体,得到三株Mgb1/Mgg1双缺失突变子（AMgb1ΔMgg1-23,34,39）。3.Mgb1和Mgg1基因敲除突变子的分析分析Mgb1,Mgg1的单缺失和双缺失突变子的菌落形态、显微特征及产色素和桔霉素能力的变化。与出发菌株M-7相比,ΔMgb1、ΔMgg1和ΔMgblΔMgg1三类突变子在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上菌落生长均减慢,且在PDA和麦芽汁琼脂培养基（MA）上不产闭囊壳,表明G蛋白β和γ亚基是红曲菌营养生长和繁殖所必须的调节蛋白。酵母膏蔗糖培养基（YES）发酵16d后,与M-7相比（8.82±0.41U/mL,OD485nm）,ΔMgb1、AMgg1和ΔMgblΔMgg1产色素能力明显提高,分别达到19.41±0.90、20.46±0.29和38.83±0.52 U/mL；并且AMgb1、ΔMgg1和△Mgb1ΔMgg1产桔霉素能力也明显提高,分别达到38.80±2.56、41.27±2.76和34.70±1.23μg/mL,而M-7发酵液中的桔霉素含量为21.46±0.25μg/mL。表明G蛋白β和γ亚基均可以负调控红曲菌产色素和桔霉素的能力。4.Mgbl和Mgg1基因过表达载体的构建及突变子的分析分别以neoR和hph为筛选标记,构建Mgb1和Mgg1基因的过表达载体pCNB和pCHG,同时转化出发菌株M-7和敲除菌株,得到NB-M7,NB-△B,HG-M7和HG-ΔG四类突变子。比较四类突变菌株和出发菌株的菌落形态和显微特征,无显著差异。YES发酵结果表明,四类突变子产桔霉素能力均低于出发菌株,约为M-7的50%；统计结果分析表明,突变子与出发菌株产色素能力变化不显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 红曲菌
• 1.1 红曲菌的生物学特征
• 1.2 红曲菌的分类
• 1.3 红曲菌的主要代谢产物
• 1.3.1 红曲色素
• 1.3.2 桔霉素
• 1.3.3 其它活性物质
• 2 G蛋白
• 2.1 G蛋白及其偶联的信号转导途径
• 2.1.1 G蛋白的结构和种类
• 2.1.2 G蛋白偶联的信号转导途径
• 2.2 G蛋白β与γ亚基的结构和功能
• 2.3 真菌中G蛋白β与γ亚基基因的研究进展
• 3 丝状真菌基因功能研究的方法
• 3.1 丝状真菌的遗传转化方法
• 3.1.1 PEG介导的原生质体的转化
• 3.1.2 电激转化
• 3.1.3 限制性内切酶介导的遗传转化
• 3.1.4 根癌农杆菌介导的遗传转化
• 3.2 基因敲除
• 3.3 RNA干扰
• 3.4 过表达
• 4 研究目的、意义、内容与路线
• 4.1 目的与意义
• 4.2 主要研究内容
• 4.3 研究路线
• 第二章 红色红曲菌G蛋白β和γ亚基基因缺失菌株的构建
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 农杆菌介导的转化所需试剂和培养基
• 1.5 主要仪器与设备
• 1.6 基因序列
• 2 方法
• 2.1 红曲菌基因组DNA的提取
• 2.2 大肠杆菌感受态的制备,转化及质粒提取
• 2法制备大肠杆菌DH5α感受态'>2.2.1 CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态
• 2.2.2 热激法转化大肠杆菌DH5α
• 2.2.3 碱裂解法提取质粒
• 2.3 G蛋白β和γ亚基基因敲除载体的构建
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 构建敲除盒
• 2.3.3 构建敲除载体
• 2.4 敲除载体转化农杆菌
• 2.4.1 农杆菌EHA105感受态细胞的制备
• 2.4.2 冻融法将质粒转入农杆菌
• 2.5 农杆菌介导的红曲菌转化
• 2.5.1 红曲菌孢子的制备
• 2.5.2 农杆菌的诱导
• 2.5.3 红曲菌孢子与农杆菌共培养
• 2.5.4 转化子的筛选
• 2.6 敲除子的筛选及验证
• 2.6.1 PCR方法筛选红曲菌突变子
• 2.6.2 Southern杂交验证
• 3 结果与分析
• 3.1 G蛋白β亚基和γ亚基的生物信息学分析
• 3.2 敲除盒的构建
• 3.3 敲除载体的构建及验证
• 3.4 敲除载体转化农杆菌
• 3.5 ΔMgb1和ΔMgg1突变子的PCR筛选与验证
• 3.6 ΔMgb1和ΔMgg1突变子的Southern杂交验证
• 3.7 ΔMgb1ΔMgg1突变子的筛选及验证
• 3.7.1 ΔMgb1 ΔMgg1突变子的PCR筛选与验证
• 3.7.2 ΔMgb1 ΔMgg1突变子的Southern杂交验证
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第三章 红色红曲菌G蛋白β和γ亚基基因缺失突变子分析
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 培养基
• 2 方法
• 2.1 缺失突变子的菌落形态和显微特征观察
• 2.2 缺失突变子的YES发酵分析
• 2.2.1 缺失突变子生物量的分析
• 2.2.2 缺失突变子色素的测定
• 2.2.3 缺失突变子桔霉素的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 缺失突变子的菌落形态和显微特征
• 3.2 缺失突变子生物量的分析
• 3.3 缺失突变子产色素及桔霉素的分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第四章 红色红曲菌G蛋白β和γ亚基基因过表达载体的构建及突变子分析
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基、主要试剂及主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 构建过表达载体
• 2.2.1 构建G蛋白β亚基Mgb1基因过表达载体
• 2.2.2 构建G蛋白γ亚基Mgg1基因过表达载体
• 2.3 农杆菌介导的红曲菌转化
• 2.4 突变子的筛选及验证
• 2.5 突变子的性质分析
• 2.5.1 突变子的菌落形态和显微特征
• 2.5.2 突变子的YES发酵分析
• 3 结果与分析
• 3.1 过表达突变载体的构建
• 3.1.1 G蛋白β亚基Mgb1基因过表达载体的构建
• 3.1.2 G蛋白γ亚基Mgg1基因过表达载体的构建
• 3.2 突变子的筛选及验证
• 3.3 突变子的功能分析
• 3.3.1 突变子的菌落形态和显微特征
• 3.3.2 突变子的生物量分析
• 3.3.3 突变子产色素及桔霉素的分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 3 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 Mgb1的DNA序列
• 附录2 Mgb1编码的氨基酸序列
• 附录3 Mgb1氨基酸序列的CLUSTAL W多重比对
• 附录4 Mgg1的DNA序列
• 附录5 Mgg1编码的氨基酸序列
• 附录6 Mgg1氨基酸序列的CLUSTALW多重比对