一维固相pH梯度等电聚焦与生物质谱联用鉴定混合蛋白质的方法建立与应用

论文摘要

建立了一种基于一维固相pH梯度等电聚焦电泳（1D IPG-IEF）结合MALDI-TOF-MS,CapLC-Nanoflow-MS/MS和MALDI-TOF-TOF-MS鉴定混合蛋白质的方法。本研究考察了1D IPG-IEF的上样量、染色方法、重复性和胶内酶切技术。详细比较了5种染色方法的效果,B2法无“酸性端歧视效应”,脱色速度快,与质谱兼容,在功能蛋白质组学研究中有应用前景。优化了IPG胶条的胶内酶切实验技术。1D IPG-IEF比1D SDS PAGE分离能力高,更适合鉴定蛋白质异构体。1D IPG-IEF也可无需酶切直接分析胶内蛋白质。 将上述方法用于人白血病细胞K562提取物的蛋白质鉴定,共鉴定出33个蛋白质。12个蛋白质与文献报道相同。其中用MALDI-TOF-TOF-MS鉴定出18个蛋白质;用LC-MS/MS鉴定出16个蛋白质,平均由3～5个肽段（最多7个）鉴定一个蛋白质,具有较高可信度,适合分析较复杂蛋白质混合物。 用阿糖胞苷（Ara-c）诱导HL-60细胞凋亡,用透射电镜进行细胞形态学观察。给药6h后,HL-60细胞出现早期凋亡特征,24h后HL-60细胞进入凋亡中晚期。构建了HL-60细胞凋亡全过程的1D IPG-IEF差异表达图谱。未经Ara-c处理的HL-60细胞的IPG-IEF有49个条带,经Ara-c作用6、12、24、36h后条带分别减少到30、29、29和28条,约减少40%,碱性蛋白条带减少幅度大。差异蛋白条带经De novo测序,鉴定了6个较重要蛋白质。其中组蛋白H2B只在给药6h时出现且相对量很高,可能是HL-60细胞早期凋亡的特征之一。核内不均一核糖核蛋白异构体A1在两种白血病细胞中均出现,有可能作为潜在的诊断标志物之一。延长因子1a样蛋白与蛋白质生物合成、蛋白降解、信号转导通路有关。蛋白量随给药时间的变化主要呈现4种类型:山峰型的峰顶在给药6h,可能与凋亡启动相关;峭壁型的转折点在给药24h,这些蛋白可能有抗凋亡作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 一维固相pH梯度等电聚焦与生物质谱联用鉴定混合蛋白质的方法建立
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.2 固相pH梯度等电聚焦电泳的条件
• 2.3 染色
• 2.3.1 0.1％考马斯亮蓝R-250染色
• 2.3.2 0.1％考马斯亮蓝G-250染色
• 2.3.3 银染
• 2.3.4 荧光染色
• 2.3.5 B2染色
• 2.4 胶内酶切
• 2.5 质谱分析
• 2.6 数据库查询
• 2.7 1D SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）
• 3 结果
• 3.1 蛋白质的上样量、染色方法的建立
• 3.1.1 蛋白质上样量的考察
• 3.1.2 蛋白质染色方法的筛选
• 3.1.2.1 0.1％考马斯亮蓝R-250的染色
• 3.1.2.2 0.1％考马斯亮蓝G-250的染色
• 3.1.2.3 银染
• 3.1.2.4 荧光染色
• 3.1.2.5 B2染色
• 3.1.2.6 IPG胶条五种染色方法的比较
• 3.2 蛋白条带等电点重复性的考察
• 3.3 方法的灵敏度
• 3.4 IPG胶条胶内酶切方法的探索
• 3.4.1 IPG胶条胶内酶切方法优化前的结果
• 3.4.2 IPG胶条胶内酶切方法优化后的结果
• 3.4.3 B2染色的IPG胶条胶内酶切方法
• 3.5 考染与B2染色方法的比较
• 3.6 与1D SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）的比对实验
• 4 讨论
• 4.1 IPG IEF分离混合蛋白质的优点
• 4.2 蛋白质上样量和分离效果
• 4.3 IPG胶条胶内酶切方法的优化
• 4.4 几种染色方法蛋白条带等电点的分布
• 4.5 IPG胶条五种染色方法的比较
• 4.6 与1D SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）的比对实验
• 5 小结
• 第二部分 1D IPG-IEF与生物质谱联用技术应用实例
• 第一章 人K562红白血病细胞蛋白质提取物的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 K562细胞的培养
• 1.3 K562细胞蛋白样品的制备
• 1.4 蛋白质定量
• 1.5 固相pH梯度等电聚焦的电泳条件及染色
• 1.6 胶内酶切
• 1.7 质谱分析
• 1.8 数据库查询
• 2 结果
• 2.1 CapLC-Nanoflow-MS／MS鉴定K562细胞样品中的蛋白质
• 2.2 MALDI-TOF-TOF-MS鉴定K562细胞样品中的蛋白质
• 3 讨论
• 3.1 1D IPG-IEF方法的特点
• 3.2 K562细胞中部分鉴定蛋白质的功能分析
• 3.3 K562细胞中某些蛋白质的生物学意义
• 4 小结
• 第二章 阿糖胞苷（Ara-c）诱导HL-60细胞凋亡差异蛋白质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 细胞培养
• 1.3 阿糖胞苷（Ara-c）原液的配制
• 1.4 阿糖胞苷（Ara-c）诱导HL-60细胞凋亡模型的建立
• 1.5 HL-60细胞蛋白样品的制备
• 1.6 蛋白质定量
• 1.7 透射电镜样品的制备
• 1.8 固相pH梯度等电聚焦的电泳条件及染色
• 1.9 胶内酶切
• 1.10 质谱分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 Ara-c诱导HL-60细胞凋亡的透射电镜观察
• 2.2 对照组和Ara-c处理的HL-60细胞诱导凋亡的等电聚焦电泳图谱
• 2.3 等电聚焦电泳差异蛋白质条带的鉴定结果
• 2.4 质谱鉴定的差异蛋白相对量变化及其与凋亡的关系分析
• 2.5 蛋白相对量与时间的动态关系
• 3 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略语表
• 致谢
• 在读期间撰写与发表文章
• 发表文章
• 综述