空肠弯曲菌peblA和cadF的克隆表达及多克隆抗体制备与纯化

论文摘要

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是一种导致人类发生急性肠炎与食物中毒的、危害仅次于沙门氏菌和志贺氏菌的人畜共患病原菌。建立空肠弯曲菌快速的检测方法,是有效预防和控制其疾病发生的重要手段。通常检测空肠弯曲菌的方法有分离培养方法、生化检测、免疫学检测、分子生物学方法等。免疫学快速筛查方法在病原微生物的检测中具有重要的应用价值,目前在空肠弯曲菌的快速检测方面,相关产品及技术甚少。获得针对空肠弯曲菌的特异性抗体,是建立空肠弯曲菌的免疫学快检方法的首要前提。为此,本文开展了以下研究。本文首先在大量文献调研的基础上,确定了空肠弯曲菌的外膜蛋白PEB1、CadF作为特征性抗原。其编码的基因序列相对保守,且在不同的血清型空肠弯曲菌中均有表达,提示可作为检测抗原。采用分子生物学的技术手段,本文成功克隆表达了PEB1和CadF两种外膜蛋白,利用镍离子亲和柱纯化了表达产物。以PEB1和CadF两种纯化蛋白免疫新西兰长耳兔,分别制备了相应的多克隆抗体,其效价分别为1:1024000和1：128000。本文利用斑点杂交的方法,发现PEB1抗血清与绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、保加利亚乳杆菌、福氏志贺菌等存在交叉反应,CadF抗血清与普通变性杆菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和短双歧杆菌等存在交叉反应。为此,本文采用辛酸硫酸铵沉淀法,去除了血清中的杂蛋白。进一步采用磁珠法,消除了两种抗血清与上述微生物的交叉反应,获得了高纯度和高特异性的抗体。本文研究结果将为建立空肠弯曲菌的免疫学检测方法,奠定技术基础、提供实验材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 空肠弯曲菌检测方法的国内外研究进展
• 1.1 概述
• 1.2 空肠弯曲菌的主要表面抗原
• 1.2.1 脂多糖
• 1.2.2 鞭毛蛋白
• 1.2.3 外膜蛋白
• 1.3 国内外检测空肠弯曲菌的方法
• 1.3.1 传统生化检测方法
• 1.3.2 分子生物学方法
• 1.4 论文研究的目的和意义
• 第二章 空肠弯曲菌peblA和cadF基因的克隆、表达和纯化
• 摘要
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料、设备与仪器
• 2.2.1 菌株及质粒
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 试剂配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 空肠弯曲菌peblA和cadF的克隆
• 2.3.2 目的蛋白的诱导表达
• 2.3.3 重组目的蛋白的纯化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 基因组DNA的提取
• 2.4.2 目的基因的PCR扩增后结果
• 2.4.3 PCR产物回收结果
• 2.4.4 阳性克隆子的验证
• 2.4.5 peblA、cadF基因核酸比对结果与分析
• 2.4.6 peblA、cadF片段及pET-28a、pET-30a质粒双酶切纯化结果
• 2.4.7 表达载体质粒的提取与双酶切验证阳性克隆子
• 2.4.8 重组PEB1和CadF蛋白的诱导表达及表达形式的鉴定
• 2.4.9 重组PEB1和CadF蛋白表达量和IPTG浓度的关系
• 2.4.10 SDS-PAGE验证纯化结果
• 2.5 讨论
• 第三章 PEB1和CadF蛋白多克隆抗体的制备
• 摘要
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料、设备与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器设备及试剂
• 3.2.3 菌株及质粒
• 3.2.4 试剂配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 抗血清的制备
• 3.3.2 间接ELISA法检测抗体效价
• 3.3.3 多克隆抗体的特异性检测
• 3.3.4 多克隆抗体的初步纯化
• 3.3.5 多克隆抗体的特异性纯化
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 抗血清效价
• 3.4.2 抗体纯化结果
• 3.4.3 交叉反应结果
• 3.5 讨论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.1.1 构建了PEB1和CadF蛋白的大肠杆菌表达系统
• 4.1.2 制备及纯化PEB1和CadF蛋白
• 4.1.3 制备抗PEB1和CadF蛋白的多克隆抗体及特异性检测
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A1 仪器设备
• 附录A2 试剂
• 附录B DNA测序结果
• 附录C 质粒图谱
• 个人介绍
• 攻读学位期间的研究成果
• 获奖情况