近海副溶血弧菌和甲肝病毒检测方法建立及沉积物细菌多样性分析

论文摘要

海洋环境中存在着大量的病原微生物，其中既有导致海洋生物疾病的病原微生物、人类传染病病原微生物，亦有导致人与海洋生物共患的病原微生物。这些病原微生物的存在和散播，对海水养殖业构成了很大威胁，同时又可通过食物链进入人体，导致人传染病爆发流行。因此，开展海洋病原微生物的监测，对于评估海产食品安全，进行疾病的早期预警预报，减少相关的经济损失，具有重要的应用推广价值。近年来，随着我国沿海城乡人口的日益增长，城乡生活污水的排海量亦逐年增加，致使生活污水中大量的人类病原微生物随之进入海洋环境，分布于海水、生物体以及沉积物当中。它们不仅对海洋生物可造成巨大危害，进而影响海洋生态系统的稳定性，而且还可通过与海水、沉积物等的接触，或海产品的食用而危害人体健康。1988年上海因食用毛蚶引发甲型肝炎大流行，即是海水中甲肝病毒（Hepatitis A virus，HAV）通过贝类进入食物链导致人疾病爆发的典型实例。排污入海口处沉积物中细菌的存在，对人体健康存在着一定的潜在威胁，亦有必要对排污入海口处沉积物中细菌进行检测。另外，目前病害已经成为制约海水养殖业健康发展的瓶颈，凡纳滨对虾是世界养殖虾类产量最高的三大种类之一，近年来频频受到红体病的侵袭，对其进行病原微生物的分离鉴定及相应检测方法的建立是十分必要的。在我国，对海洋病原微生物的检测一直沿用传统的检测手段，缺少系统、快速的检测方法，因而难以开展常规监测。因此，建立系统、特异、简便、快速、准确的海洋病原微生物检测方法是十分必要的。本研究选定凡纳滨对虾红体病病原菌—副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、海水中以及贝类体内的甲肝病毒、排污入海口处沉积物中细菌作为研究代表，从实际应用出发，初步系统地建立起高效、灵敏的检测方法。并在我国首次将聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）的方法应用于海洋沉积物中病原微生物多样性的分析。本研究通过优势菌分离、回归感染实验、生理生化特性以及16S rRNA基因分析，将从患红体病的凡纳滨对虾体内分离到的病原菌确定为副溶血弧菌。以副溶血弧菌为抗原，免疫新西兰兔获得高免血清，建立了检测副溶血弧菌的三种免疫学检测方法，分别为间接酶联免疫吸附试验法（Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay，iELISA）、斑点ELISA（Dot-ELISA）方法、间接荧光抗体（Indirect Fluorescent Antibody，IFA）检测方法。三种免疫学检测方法均具有较高的稳定性和特异性；灵敏性从高到低排列依次为：IFA、iELISA、Dot-ELISA；检测所用时间均很快速，分别为2h、9h、7h；所需仪器设备方面，Dot-ELISA方法所需仪器设备最简单，最适于现场调查应用。另外，根据副溶血弧菌耐热直接溶血毒素（TDH）的保守阅读框pR72H基因序列设计引物，采用热裂解法提取副溶血弧菌的DNA，建立了PCR方法。所建立的PCR方法灵敏度较高，检出限能够达到90～100CFU；特异性较强，能够在2h内完成检测。采用吸附-洗脱的原理，建立了从海水中浓缩甲肝病毒的方法；采用氯仿去除脂蛋白、聚乙二醇浓缩的原理，建立了从贝类体内浓缩甲肝病毒的方法；在此基础之上，建立了检测甲肝病毒的“RT-PCR扩增—聚丙烯酰胺凝胶电泳—银染色方法”。将该方法应用到辽东湾重点

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1 引言

1.1 研究背景与科学意义

1.2 国内外文献综述

1.2.1 凡纳滨对虾红体病病原因分析

1.2.2 病原性海洋弧菌的快速检测方法

1.2.3 海洋环境中的人类传染病病毒

1.2.4 海洋环境中的人类传染病病毒检测手段的发展

1.2.5 海洋细菌的多样性

1.3 本研究课题的来源及主要研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验用虾、兔

2.1.2 海水、贝类以及沉积物样品

2.1.3 标准菌株

2.1.4 常规化学试剂

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 主要分子生物学软件

2.2 方法

2.2.1 缓冲液及常用试剂配制

2.2.2 凡纳滨对虾红体病病原菌的确定

2.2.3 凡纳滨对虾红体病病原菌的检测

2.2.4 海水中及贝类体内甲肝病毒的检测

2.2.5 辽东湾重点沿岸海域甲肝病毒的分布

2.2.6 海洋沉积物中细菌多样性分析

2.2.7 大连市重点排污口沿岸海域沉积物中细菌多样性分析

3 结果与分析

3.1 凡纳滨对虾红体病病原菌的确定

3.1.1 自然发病的凡纳滨对虾红体病症状

3.1.2 副溶血弧菌形态特征

3.1.3 回归感染结果

3.1.4 生理生化特性

3.1.5 16S rRNA基因鉴定结果

3.1.6 药敏试验结果

3.2 凡纳滨对虾红体病病原菌的检测方法

3.2.1 ELISA检测方法的标准化

3.2.2 ELISA检测方法的临床应用

3.2.3 Dot-ELISA检测方法的标准化

3.2.4 间接免疫荧光抗体检测方法

3.2.5 PCR检测结果

3.3 甲肝病毒的检测结果

3.3.1 海水中的甲肝病毒

3.3.2 贝类样品中的甲肝病毒

3.4 海洋沉积物中细菌多样性的PCR-DGGE结果

3.4.1 海洋沉积物中细菌 DNA的提取结果

3.4.2 海洋沉积物中细菌 DNA的PCR扩增结果

3.4.3 海洋沉积物中细菌 DNA的DGGE电泳结果

3.4.4 海洋沉积物中细菌 DNA的DGGE电泳切胶回收结果

3.5 沿岸海洋沉积物中细菌种类确定

3.5.1 海洋沉积物中细菌 DNA测序结果

3.5.2 海洋沉积物中细菌 DNA序列比对结果

3.5.3 海洋沉积物中细菌的系统发生树

4 讨论

4.1 凡纳滨对虾红体病病原的识别

4.2 凡纳滨对虾红体病病原菌的检测方法

4.2.1 凡纳滨对虾红体病病原菌的ELISA检测方法

4.2.2 凡纳滨对虾红体病病原菌的Dot-ELISA检测方法

4.2.3 凡纳滨对虾红体病病原菌的IFA检测方法

4.2.4 凡纳滨对虾红体病病原菌的PCR检测方法

4.3 海水中及贝类体内甲肝病毒的检测

4.4 海水中及贝类体内甲肝病毒的评价

4.5 沿岸附近沉积物中细菌的分析

4.5.1 沉积物中细菌 DNA的提取

4.5.2 沉积物中细菌的分析手段

4.6 沿岸海域沉积物中细菌的多样性

5 结论

5.1 主要结论

5.2 创新点

5.3 后续工作

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

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