棉花纤维素合酶基因克隆和表达分析

论文摘要

棉花是主要经济作物之一,是最重要的天然纺织原料。随着生活水平提高,人们对纤维品质要求也日益增高,对棉花纤维品质的改良已刻不容缓。研究棉花纤维发育机理及调控基因功能可为改良纤维品质提供重要的理论依据,同时,棉花纤维是单细胞,主要成分是纤维素,是研究植物纤维素合成机理的理想材料。纤维素是由纤维素合酶复合体在原生质膜上合成的,目前已报道的棉花纤维素合酶基因有Gh CesA1、GhCesA 2和GhCesA3,其中GhCesA1和GhCesA2是次生壁纤维素合成基因,GhCesA3是初生壁纤维素合成基因。本研究根据棉花CesAs的EST序列,克隆了棉花纤维素合酶基因GhCesA5、GhCesA8和GhCesA10的全长CDs。GhCesA5全长3288bp,编码1096个氨基酸,GhCesA8全长3120bp,编码1039个氨基酸,GhCesA10全长3207bp,编码1069个氨基酸。RNA表达分析表明,GhCesA5和GhCesA10在整个棉纤维发育时期表达持续高水平表达,是典型的初生壁纤维素合酶基因；GhCesA8在次生壁发育时期表达量迅速升高,是次生壁纤维素合酶基因。在陆地棉和海岛棉纤维发育阶段,GhCesA5和GhCesA10的表达模式一致,但是GhCesA8在海岛棉中表达早于陆地棉,且CesA5和CesA8可能存在一定的功能互补。Western Bloting结果表明,GhCESA1与GhCESA2在棉花开花后9至19天基本不表达,19天前后开始迅速增加；GhSUSY1在棉纤维发育的各个时期持续高量表达。纤维素合酶活性分析结果表明,原生质膜片段越大,酶的活性越高,并且在次生壁发育高峰期时纤维素合酶的活性最高。转基因技术已经成为棉花遗传育种的重要方法,改变纤维素合成关键基因的表达,可能改良纤维品质。本研究选择GhSuSy1和GhSGT1基因,构建了5个棉花转基因载体pC1300-SCFP-GhSuSy1、pC1300-SCFP-GhSGT1、pC1300-E6-GhSGT1、pART-E6-GhSGT1和pART-E6-GhCAL,用花粉管通道法进行棉花转基因操作,已获得部分转基因T0代种子,阳性苗正在筛选中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写名词表
• 1 文献综述
• 1.1 植物细胞壁研究进展
• 1.1.1 细胞壁结构
• 1.1.2 细胞壁组成
• 1.2 纤维素合酶
• 1.2.1 纤维素合酶的发现
• 1.2.2 纤维素合酶结构
• 1.2.3 纤维素合酶复合体的组成与功能
• 1.2.4 纤维素合成相关基因
• 1.2.5 纤维素合酶活性分析
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 RACE
• 2.2.2 PCR扩增与产物回收
• 2.2.3 PCR产物与载体连接
• 2.2.4 大肠杆菌和农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 阳性克隆的检测与测序
• 2.2.7 质粒提取方法
• 2.2.8 农杆菌质粒的提取
• 2.2.9 棉花RNA的提取
• 2.2.10 棉花自交方法
• 2.2.11 棉花花粉管通道法转基因
• 2.2.12 原核表达与纯化
• 2.2.13 棉花膜蛋白的提取
• 2.2.14 免疫共沉淀（Co-IP）
• 2.2.15 Western Bloting检测
• 2.2.16 纤维素合酶酶活分析
• 3 结果与分析
• 3.1 GhCesA5、GhCesA8和GhCesA10 cDNA克隆
• 3.1.1 序列比对与引物设计
• 3.1.2 GhCesA5和GhCesA10 cDNA序列克隆
• 3.1.2.1 GhCesA5和GhCesA10锌指结构区克隆
• 3.1.2.2 GhCesAS和GhCesA105’端序列扩增
• 3.1.2.3 GhCe刘0j3’端序歹Jl扩增
• 3.1.3 GhCesA8 cDNA序列克隆
• 3.2 GhCesA5、GhCesA8和GhCesA10生物信息学分析
• 3.2.1 催化活性区分析
• 3.2.2 跨膜结构域分析
• 3.2.3 磷酸化位点预测
• 3.2.4 分子量和等电点分析
• 3.2.5 CESAs保守域分析
• 3.2.6 CESA家族蛋白聚类分析
• 3.2.7 在棉纤维不同发育时期表达分析
• 3.3 GhCESA5、GhCESA8和GhCESA10抗原制备
• 3.3.1 抗原区段的选择
• 3.3.2 原核表达载体的构建
• 3.3.3 蛋白的表达
• 3.4 GhCESA1、GhCESA2和GhSUSY1蛋白表达分析
• 3.4.1 棉花纤维不同发育时期蛋白表达检测
• 3.4.2 棉花下胚轴光暗处理蛋白表达分析
• 3.4.3 陆地棉24天纤维素合酶复合体的组成分析
• 3.5 纤维素合酶活性分析
• 3.5.1 膜片段大小对纤维素合酶活性的影响
• 3.5.2 棉纤维不同发育时期纤维素合酶的体外活性分析
• 3.6 棉花转基因
• 3.6.1 GhSGT1和GhSuSy1超表达载体构建
• 3.6.2 GhSGT和GhCa1 RNAi载体构建
• 3.6.3 农杆菌的转化及棉花花粉管通道注射
• 4 讨论
• 4.1 不同棉花RNA提取方法比较
• 4.2 GhCesAs生物信息学分析
• 4.3 棉纤维不同发育时期蛋白表达模式分析
• 4.4 纤维素合酶体外活性分析
• 4.5 GhSGT1和GhSuSy1在纤维发育中的作用
• 4.6 总结和展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢