盐芥耐盐相关基因的功能研究

论文摘要

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一。土壤中高浓度的Na+对许多的高等植物都造成很大的伤害,严重影响着植物的生长和发育,导致世界作物的大量减产。植物消除Na+毒害的策略包括:降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的区隔化。目前Na+吸收过程还不十分清楚,但Na+的外排和区隔化是间接的主动运输过程,主要由Na+/H+逆向转运蛋白来完成。Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐逆密切相关,近年来受到广泛关注,成为国际研究的热点之一,它利用质膜H+-ATPase或液泡膜H+-ATPase及H+-PPase泵H+产生的驱动力把Na+排出细胞或将其区隔化入液泡中以消除Na+的毒害。到目前为止,拟南芥一直是研究植物分子生物学途径的最好模式材料,但拟南芥是真正的甜土植物,因此,使用拟南芥将只能揭示关于植物耐盐性较少的信息。作为拟南芥近缘的盐芥,是很有前景的植物耐盐模式系统。本实验的主要目的是利用盐芥为研究材料,对其耐盐相关的基因ThNHX1和P5CS进行研究,揭示其与盐芥耐盐性的关系,并对盐芥EMS突变体的创制进行了初步探讨。主要实验结果如下:1、盐芥ThNHX1基因的克隆和功能分析1)根据其它物种中保守的NHX1基因的序列,设计引物,利用RT-PCR和RACE的方法从盐芥中克隆获得ThNHX1基因的全长序列。该基因全长2031 bp,开放的阅读框架为1635 bp,5’非编码区为146 bp,3’非编码区为250 bp。全序列由第147核苷酸处ATG开始编码氨基酸,至1781核苷酸处为终止密码子共编码545个氨基酸,分子量约为60 KD。2)对该基因的序列特征做了详细的分析,ThNHX1基因与已报道的拟南芥中液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1的同源性最高,推测其编码的氨基酸序列在N端具有12个跨膜的结构域,DNAMAN软件对不同物种中液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因所作的系统进化分析表明ThNHX1与AtNHX1、AtNHX2和BnNHX1亲缘关系最近。3)ThNHX1基因在酵母突变体AXT3（ena1-4 nha1 nhx1）中的互补分析表明,ThNHX1基因的表达提高了突变体对Na+和Li+的耐性,表明ThNHX1基因是一个有功能的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因。4)对ThNHX1基因在不同胁迫下的表达特性进行了详细的分析。Northern杂交结

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 盐胁迫对植物的影响
• 1.1 盐胁迫对植物生长的影响
• 1.2 盐胁迫对离子含量的影响
• 1.3 盐胁迫对光合作用的影响
• 1.4 盐胁迫对抗氧化物酶和抗氧化物的影响
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物的耐盐性'>2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物的耐盐性
• +/H⁺逆向转运蛋白—Na⁺外排'>2.1 质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白—Na⁺外排
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2.1.1 酵母中质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白的重要氨基酸残基和C 端的功能'>2.1.2 酵母和真菌质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的重要氨基酸残基和C 端的功能
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2.1.3 植物中质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• 2.1.4 SOS 基因家族及其信号转导
• 2.1.4.1 SOS 基因家族
• 2.1.4.2 SOS 信号通路
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2.2 叶绿体Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白—Na⁺区隔化'>2.3 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白—Na⁺区隔化
• +/H⁺逆向转运蛋白的分子生物学特征'>2.3.1 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的分子生物学特征
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系'>2.3.2 液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2.3.2.1 盐胁迫与液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白基因植株与其耐盐性'>2.3.2.2 转Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因植株与其耐盐性
• 3 盐芥（Thellungiella halophila）—新型耐盐模式植物
• 4 EMS 突变体的创制及其意义
• 4.1 突变体的获得途径
• 4.2 EMS 诱变的机理
• 4.3 EMS 突变体及其意义
• 5 本实验的意义
• 第二部分 实验论文
• 第一章 盐芥ThNHX1 基因的功能研究
• 一、实验材料
• 1 植物材料
• 2 质粒及菌种
• 3 酶及化学试剂
• 4 主要仪器设备
• 5 培养基
• 6 质粒提取液
• 7 引物序列
• 二、实验方法
• 1 植物材料处理
• +/H⁺逆向转运蛋白基因 ThNHX1 cDNA 的克隆与测序'>2 盐芥Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因 ThNHX1 cDNA 的克隆与测序
• 3 基本分子生物学实验技术
• 3.1 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 3.2 质粒的提取
• 3.3 PCR、酶切验证以及连接
• 3.4 Gene Clean 方法从琼脂糖凝胶上回收外源基因片段
• 3.5 植物基因组DNA 的提取和Southern 杂交膜的制备
• 3.5.1 植物基因组DNA 的提取
• 3.5.2 Southern 杂交膜的制备
• 3.6 异硫氰酸胍法提取总RNA 和Northern 杂交膜的制备
• 3.6.1 异硫氰酸胍法提取总RNA 和检测
• 3.6.2 Northern 杂交膜的制备
• 3.6.2.1 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳
• 3.6.2.2 RNA 杂交膜的制备
• 3.7 Southern 杂交和Northern 杂交分析
• 3.7.1 cDNA 探针的制备
• 3.7.2 杂交过程
• 4 植物表达载体pROKII-ThNHX1 和基因沉默载体的构建
• 4.1 植物表达载体pROKII-ThNHX1 的构建
• 4.2 ThNHX1 基因沉默载体的构建
• 5 植物表达载体的农杆菌转化、农杆菌质粒的提取与鉴定
• 6 渗透法转化拟南芥和盐芥
• 6.1 植物表达载体pROKII-ThNHX1 渗透转化拟南芥
• 6.1.1 拟南芥的生长
• 6.1.2 菌液的准备
• 6.1.3 渗透转化
• 6.2 植物基因沉默表达载体pCAMBIA3301-E/K-ThNHX1-pINT4 intron-B/S-ThNHX1 渗透转化盐芥
• 7 转化子的筛选及遗传分析
• 7.1 拟南芥转化子的筛选及遗传分析
• 7.1.1 转化子的筛选
• 7.1.2 转化子的遗传分析
• 7.2 盐芥转化子的筛选
• 8 转基因植株外源基因检测
• 8.1 转基因拟南芥外源ThNHX1 基因的PCR 检测
• 8.2 转基因盐芥ThNHX1 基因表达的Real-time PCR 分析
• 8.2.1 转基因盐芥材料的处理
• 8.2.2 RNeasy Mini Kit 法提取植物总RNA
• 8.2.3 RNA 的定量
• 8.2.4 RNA 的反转录及cDNA 模板的稀释
• 8.2.5 实时定量PCR 引物的设计
• 8.2.6 实时定量PCR（Real-time PCR）
• 8.3 转基因植株外源ThNHX1 基因的Southern 杂交
• 8.4 转基因植株外源ThNHX1 基因的Northern 杂交
• 9 转基因拟南芥植株耐逆性分析
• 9.1 野生型与转基因拟南芥在含NaCl 培养基上的萌发及生长情况
• 9.2 野生型与转基因拟南芥在含LiCl 培养基上的生长情况
• 9.3 野生型与转基因拟南芥成苗盐胁迫处理
• 9.4 野生型植株及转基因植株基础生长指标的测定
• 9.4.1 干、鲜重的测量
• +、K⁺离子含量的测定'>9.4.2 Na⁺、K⁺离子含量的测定
• 9.4.3 野生型植株和转基因植株光合指标的测定
• 10 转基因盐芥植株耐逆性分析
• 10.1 野生型与转基因盐芥在含NaCl 培养基上的生长情况
• 10.2 野生型与转基因盐芥在含甘露醇培养基上的生长情况
• 10.3 野生型与转基因盐芥成苗盐胁迫处理
• 10.4 植物材料含水量的测定
• 10.5 脯氨酸含量的测定
• 10.5.1 标准曲线的绘制
• 10.5.2 植株样品液的制备与测定
• 10.5.3 脯氨酸含量的计算
• 三、实验结果
• 1 ThNHXI 基因的克隆及序列获得
• 1.1 ThNHX1 氨基酸序列分析
• 1.2 ThNHX1 基因系统谱系分析
• 1.3 ThNHX1 亲水性分析
• 2 酵母功能互补验证
• 3 ThNHX1 基因在不同胁迫条件下的特异性表达分析
• 4 植物表达载体的构建及农杆菌的转化
• 4.1 ThNHX1 基因的定向克隆
• 4.2 植物表达载体的构建
• 4.2.1 过量表达ThNHX1 植物表达载体的构建
• 4.2.2 ThNHX1 基因沉默表达载体的构建
• 4.3 农杆菌的转化
• 5 转基因拟南芥与盐芥的筛选
• 5.1 转基因拟南芥的筛选
• 5.2 纯系转基因拟南芥的获得
• 5.3 转基因盐芥的筛选
• 6 转基因拟南芥与盐芥的分子验证
• 6.1 转基因拟南芥的PCR 鉴定
• 6.2 转基因拟南芥的Southern 鉴定
• 6.3 转基因拟南芥的Northern 鉴定
• 6.4 转基因盐芥的Real-Time PCR 鉴定
• 6.4.1 盐芥总RNA 的提取
• 6.4.2 转基因盐芥ThNHX1 的实时定量PCR 表达分析
• 7 转基因拟南芥的耐逆性分析
• 7.1 转基因拟南芥在不同盐胁迫条件下的生长情况
• 7.2 盐处理对转基因植株与野生型植株干、鲜重的影响
• 7.3 盐处理对转基因植株与野生型植株光合速率的影响
• +、K⁺离子含量变化情况'>7.4 转基因植株与野生型植株中Na⁺、K⁺离子含量变化情况
• 8 转基因盐芥的耐逆性分析
• 8.1 野生型与转基因盐芥在含NaCl 培养基上的生长情况
• 8.2 野生型与转基因盐芥在含甘露醇培养基上的生长情况
• 8.3 野生型与转基因盐芥成苗盐胁迫处理
• 8.4 盐处理对转基因植株与野生型植株含水量的影响
• 8.5 盐处理对转基因植株与野生型植株脯氨酸含量的影响
• 四讨论
• +/H⁺逆向转运蛋白基因'>1 ThNHX1 基因是一个有功能的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因
• 2 导入ThNHX1 基因对拟南芥和盐芥耐盐性的影响及其作用
• 第二章 盐芥P5CS 基因的功能研究
• 一、实验材料
• 1 植物材料
• 2 菌种和质粒
• 3 化学试剂、主要仪器设备
• 4 所用引物
• 二、实验方法
• 1 植物基因组DNA 的提取
• 2 植物表达载体的农杆菌转化、农杆菌质粒的提取与鉴定
• 3 渗透法转化盐芥
• 4 转化子的筛选
• 5 转基因盐芥外源Bar 基因的PCR 检测
• 6 转基因盐芥P5CS 基因表达的Real-time PCR 分析
• 7 转基因盐芥的耐逆性分析
• 7.1 野生型与转基因盐芥成苗盐胁迫处理
• 7.2 野生型与转基因盐芥含水量的测定
• 7.3 脯氨酸含量的测定
• 三、实验结果
• 1 转基因盐芥的筛选
• 2 转基因盐芥的PCR 鉴定
• 3 转基因盐芥的Real-Time PCR 鉴定
• 3.1 盐芥总RNA 的提取
• 3.2 转基因盐芥P5CS 基因的Real-time PCR 表达分析
• 4 P5CS 基因沉默后对转基因植株表型的影响
• 5 盐处理对转基因植株与野生型植株含水量的影响
• 6 盐处理对转基因植株与野生型植株脯氨酸含量的影响
• 四讨论
• 1 RNAi 技术在植物功能基因组学研究中的应用
• 2 脯氨酸与盐芥耐盐性的关系
• 第三章 盐芥EMS 突变体创制的初步探讨
• 一、实验材料
• 1 植物材料
• 2 生化试剂
• 3 主要仪器设备
• 4 培养基
• 二、实验方法
• 1 盐芥种子灭菌的方法
• 2 盐芥野生型种子的诱变浓度及时间的选择
• 3 盐敏感突变体的筛选方法建立
• 4 盐芥盐敏感突变体筛选浓度的确定
• 5 其它表型突变体的筛选
• 三、实验结果
• 1 盐芥种子灭菌方法的优化
• 2 盐芥种子的诱变
• 3 盐芥盐敏感突变体筛选浓度的确定
• 4 盐芥盐敏感突变体的筛选
• 5 推测的盐芥盐敏感突变体的进一步鉴定
• 6 其它表型突变体的获得
• 四、讨论
• 参考文献
• 图版
• 英文缩写符号及中英对照表
• 攻读博士学位期间发表和整理的论文
• 致谢