论文摘要
第一部分EPAS1、VEGF在胰腺癌中表达的意义及相关性目的研究胰腺癌组织中缺氧诱导因子2（EPAS1/HIF-2α）、血管内皮生长因子（VEGF）和微血管密度（MVD）的表达及与临床病理特征之间的关系。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹（western blotting）、免疫组化（IHC）S-P法检测60例胰腺癌及相应正常胰腺组织中EPAS1、VEGF mRNA和蛋白的表达和分布,同时检测MVD作为判断血管生成的指标,分析其间的相关性以及与肿瘤临床病理特征之间的关系。结果EPAS1、VEGF和MVD在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织, VEGF在mRNA和蛋白水平均增高（t=6.10,P=0.0003;t=98.41,P=0.0001）,但EPAS1只在蛋白水平增高（t=22.51,P=0.0001）。此外,三者之间的表达具有显著相关性（EPAS1和VEGF之间,r=0.73583,P=0.0041;VEGF和MVD之间,r=0.85783, P= 0.0001;EPAS1和MVD间,r=0.64062,P=0.0003）, EPAS1和VEGF的阳性表达与胰腺癌的TNM分期、肿瘤大小有关。结论胰腺癌组织中EPAS1和VEGF呈过量表达,且EPAS1的表达与VEGF及MVD呈显著正相关。EPAS1可通过上调VEGF表达来促进胰腺癌血管生成从而在胰腺癌的发生发展中起重要作用。第二部分靶向EPAS1的小干扰RNA的设计与功能筛选目的构建编码EPAS1 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法根据EPAS1的基因序列设计三条shRNA作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体并通过PCR和测序进行鉴定。经鉴定正确后分别稳定转染PANC-1细胞,实时荧光定量PCR（RQ-PCR）和western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体经PCR鉴定均可扩增出预期条带,测序证明质粒构建成功。靶向EPAS1基因的shRNA对稳定转染的PANC-1细胞中EPAS1 mRNA和蛋白质表达均有抑制作用:在常氧状态下,EPAS1-shRNA-1、EPAS1-shRNA-2和EPAS1-shRNA-3对EPAS1 mRNA表达的抑制率分别为67.5%、46.8%、47.9%（P<0.05）,在缺氧状态下的抑制率分别为86.6%、55.1%、56.4%（P<0.05）;在常氧状态下,EPAS1-shRNA-1、EPAS1-shRNA-2、EPAS1-shRNA-3对EPAS1蛋白表达的抑制率分别为48.8%、18.9%、28.9%（P<0.05）,在缺氧状态下的抑制率分别为73.6%、40.0%、37.2%（P<0.05）。其中以EPAS1-shRNA-1的抑制作用最明显。结论成功构建了靶向EPAS1基因的shRNA质粒表达载体.其中抑制效果最明显的shRNA质粒表达载体为pGCsi-U6/Neo/GFP/EPAS1-shRNA-1质粒。第三部分rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA的构建与鉴定目的构建并制备携带靶向EPAS1基因的shRNA的2型重组腺相关病毒载体。方法将PCR法扩增所得EGFP-U6-EPAS1-siRNA片段插入载体质粒pSNAV2.0- lacz-α的EcoR I和Sal I酶切位点,构建重组质粒pSNAV2.0-EGFP-U6-EPAS1- siRNA。以HSV1-rc/ΔUL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA病毒。对所获病毒载体进行SDS-PAGE、PCR鉴定分析和滴度测定。结果SDS-PAGE、PCR鉴定分析结果表明靶向EPAS1基因的shRNA片段成功包装入rAAV2载体,病毒纯度在95%以上。点杂交法测定rAAV2基因组滴度约为1×1012v.g. /L。结论成功制备了rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA病毒载体。第四部分EPAS1-siRNA对人胰腺癌细胞生物学行为影响的体外研究目的观察由rAAV2携带的EPAS1-siRNA对体外培养的人胰腺癌细胞的抑制作用。方法将rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA转染入人胰腺癌细胞株PANC-1中,并测定转染效率。分别在常氧和缺氧状态下进行细胞培养。RT-PCR、IHC S-P法、western blotting检测EPAS1和VEGF mRNA和蛋白表达,MTT法检测PANC-1增殖能力,Giemsa染色、Hoechst 33342和PI双染、Annexin V-FITC/PI双染和DNA Ladder检测细胞凋亡,ABC-ELISA检测分泌性VEGF水平, CAM试验检测血管生成,CAM成瘤试验检测肿瘤生长能力。结果rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA被成功地转染入PANC-1细胞中,FCM测定转染效率在40%左右。与阴性对照组和空白对照组比较,实验组PANC-1细胞的EPAS1和VEGF mRNA的表达明显受到抑制（EPAS1 mRNA:常氧状态下,F=44.64,P=0.0002;缺氧状态下,F=53.33,P=0.0012。VEGF mRNA:常氧状态下,F=25.36,P=0.0012;缺氧状态下,F=56.62,P=0.0001）。同样的结果见于蛋白表达的检测中（EPAS1蛋白:常氧状态下,F=46.12,P=0.0002;缺氧状态下,F=602.11,P=0.0001。VEGF蛋白:常氧状态下,F=46.69,P=0.0002;缺氧状态下,F=64.56,P=0.0001）。同时,实验组细胞增殖能力下降（F=83.85,P=0.0001）,凋亡率增高（在缺氧状态下,F=124.98, P=0.0001）,分泌性VEGF水平下降（在缺氧状态下,F=9.83,P=0.0128）。实验组CAM的血管计数明显少于对照组（常氧状态下F=29.04,P=0.0008,缺氧状态下,F=88.01,P=0.0001）,CAM移植瘤生长受抑制,肿瘤体积小于对照组（F=64.04, P=0.0001）。结论在体外,rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA能抑制人胰腺癌细胞PANC-1的EPAS1和VEGF基因表达,并能抑制细胞增殖,促进凋亡,抑制CAM血管形成与移植瘤生长。第五部分EPAS1-siRNA对人胰腺癌抑制作用的体内研究目的在整体水平研究rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA对人胰腺癌生长、转移和浸润行为的抑制作用。方法建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型、腹腔转移模型和原位移植模型。在皮下模型中,按1×1012v.g./kg标准在瘤内分别注射rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA、rAAV2-EGFP和NS,观察抑瘤效果,IHC S-P法检测EPAS1、VEGF蛋白表达及MVD值,TUNEL和透射电镜检测凋亡。在腹腔转移模型中,按1×1012v.g./kg标准分别腹腔注射rAAV2 -EGFP-U6-EPAS1-siRNA、rAAV2-EGFP和NS,计数种植瘤数目。在原位模型中,按1×1012v.g./kg标准分别腹腔注射rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA、rAAV2-EGFP和NS,观察抑瘤效果及转移情况。结果实验组皮下移植瘤生长明显受抑制,体积和重量明显小于阴性对照组和空白对照组（体积,F=171.09,P=0.0001;重量,F=199.50,P=0.0001）,EPAS1、VEGF蛋白表达弱于对照组（EPAS1,H=3.18,P=0.2043;VEGF,H=6.16,P =0.046）, MVD值明显小于对照组（F=55.42,P=0.0001）,凋亡指数明显小于对照组（F= 286.57,P=0.0001）。实验组裸鼠腹腔种植瘤数目明显少于对照组（F=52.23,P=0.0001）。实验组裸鼠原位移植瘤的体积和重量明显小于对照组（体积,F=27.52,P=0.0001;重量, F=102.41, P=0.0001）,远处转移率是16.7%,而对照组裸鼠远处转移率是50%。结论在体内实验中,rAAV2-EGFP-U6-EPAS1-siRNA能明显抑制人胰腺癌的生长与转移,促进凋亡,减少新生血管形成,显示一定的抑瘤效应。
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