植酸酶基因转化棉花及转基因植株再生

论文摘要

本研究采用基因枪轰击转化技术,将外源植酸酶基因（PhyA）导入棉花茎尖分生组织,初步获得转基因植株;利用根癌农杆菌转化法将植酸酶基因导入棉花胚性愈伤组织,探讨农杆菌侵染棉花胚性愈伤的转化条件,并获得抗性胚性愈伤组织;通过花粉管通道法将PhyA基因导入棉花,获得经PCR检测的转基因植株。本研究旨在为棉花现代分子育种增添新的内容和新的种质材料,同时为解决农作物有效利用土壤有机磷资源开辟一条经济有效的途径。利用棉花茎尖分生组织易于再生的特点,将含有植酸酶基因（PhyA）的质粒包裹在金粉上,轰击转化陆地棉品种农大KB18的茎尖分生组织。摸索出了一条适合茎尖再生的途径。对轰击参数进行了综合比较,优选出最佳轰击组合,确定了适合基因枪茎尖转化体系的梯度筛选法。研究认为,培养茎尖的培养基以MSB附加30%葡萄糖,不添加或添加少量激素为佳;基因枪轰击过程中,采用轰击压力1350psi,真空度28inch Hg,轰击距离9cm,轰击1次,转化效果最佳;轰击后接入加有1g·L-1活性炭的MSB培养基中恢复培养4-7d,至组织长出绿芽点时,将其转入筛选培养基MSB+Kan(70、80、100、110、130、140mg·L-1)上进行梯度筛选,获得15株卡那霉素抗性植株。PCR分析表明有8株抗性植株含有PhyA基因,PCR-Southem杂交分析进一步证实了PhyA基因在转基因棉花基因组中的整合。从基因枪轰击到获得转化小植株大约需要3个月时间,最终转化率为2.97%。用质粒PC-KSA2300表达单元转化农杆菌菌株EHA105的感受态细胞,构建了可直接用于遗传转化的农杆菌工程菌株。为了建立农杆菌介导的棉花转基因技术体系,用获得的农杆菌菌株侵染棉花胚性愈伤组织,摸索了影响其转化的因素。结果表明:不同棉花品种间胚性愈伤组织的生长动态和对卡那霉素的敏感性有很大差异;农杆菌侵染时间在5-10分钟、共培养时在18-21℃条件下培养1-2d,转化效果较好,通过卡那霉素筛选培养,获得抗性愈伤组织。对获得的愈伤组织进行PCR检测,初步证明PhyA基因己转入棉花基因组中。花粉管通道法共转化棉铃1400个,最后成铃638个,结铃率为45.57%。将收获转化成铃的种子种植于温室,待其长出1片真叶时,用浓度为2000mg·L-1的卡那霉素进行涂抹试验,得到抗Kan植株56株,PCR检测结果表明其中有7株含有PhyA基因。

论文目录

1 引言

2 材料和方法

2.1 供试材料

2.1.1 菌株、载体和质粒

2.1.2 棉花品种

2.1.3 培养基类型与配制

2.1.4 PCR引物

2.1.5 主要仪器

2.2 试验方法

2.2.1 以茎尖分生组织为受体的基因枪转化体系

2.2.2 农杆菌介导的遗传转化

2.2.3 花粉管通道法转化质粒DNA

3 结果与分析

3.1 以茎尖分生组织为受体的基因枪转化体系的建立

3.1.1 碳源与对茎尖分生组织生长的影响

3.1.2 活性炭对茎尖培养效果的影响

3.1.3 外源激素对茎尖分生组织生长的影响

3.1.4 轰击距离和轰击次数对转化效率的影响

3.1.5 转化体的筛选和抗性再生植株的获得

3.1.6 转化植株的PCR分析

3.1.7 转化植株的PCR-Southem杂交分析

3.1.8 转化植株的嫁接结果

3.2 农杆菌介导的遗传转化

3.2.1 农杆菌中的质粒检测

3.2.2 棉花胚性愈伤组织在不加卡那霉素的培养基上的生长动态

3.2.3 卡那霉素（Kan）浓度对EC生长的影响

3.2.4 农杆菌侵染时间对转化的影响

3.2.5 共培养时间和温度对转化的影响

3.2.6 抑菌培养和选择培养的效果

3.2.7 抗性愈伤组织DNA的分子检测结果

3.3 花粉管通道法转化棉花的效果

3.3.1 花粉管通道法转化棉花

3.3.2 卡那霉素筛选结果

3.3.3 转基因棉花PhyA基因的PCR检测

4 讨论

4.1 不同遗传转化方法的评价

4.2 转化外植体的选择

4.3 卡那霉素的作用及选择方法

4.4 植酸酶基因的应用前景

5 结论

参考文献

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