细胞凋亡过程中caspase蛋白酶激活的光学成像研究

论文摘要

细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death简称PCD）,是指细胞在内、外因子的严格控制下一种有步骤有活性的生理性自行消亡的过程。现已公认,细胞凋亡后期的共同途径是caspases的激活。因此细胞内caspase蛋白酶的激活情况对研究细胞凋亡发生发展的机制变得尤为重要。然而传统方法,如化学荧光染色、免疫荧光、放射性标记等很难做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内caspase蛋白酶的激活进行动态研究。目前,一种被称为荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）也称为非辐射能量转移的技术可以很好地成像活细胞内包括蛋白酶激活的一些分子活动,从而弥补了这种缺陷。本研究基于FRET技术,应用基因工程手段针对特定的caspase蛋白酶设计FRET探针,对多种caspase蛋白酶的酶活动力学进行了实时动态地成像,在获得稳定表达该探针的细胞系后,对肿瘤细胞的凋亡路径进行了研究。主要实验结果和结论如下:1)应用基因工程手段共获得5种FRET探针,通过酶切鉴定及DNA序列分析证实这5种FRET探针与事先的理论设计在基因序列上完全吻合。5种基因探针分为两个系列:（1）FRET的供体和受体分别是ECFP和EYFP荧光蛋白的称为CY系列,所合成的探针的分别有:中间蛋白酶的识别序列为caspase-3的识别序列DEVD linker的命名为CY3,中间蛋白酶的识别序列为caspase-8的识别序列IETD linker的命名为CY8,中间蛋白酶的识别序列为caspase-9的识别序列LEHD linker的命名为CY9。（2）FRET的供体和受体分别是ECFP和DsRed2荧光蛋白的称为CD系列,所合成的探针的分别有:中间蛋白酶的识别序列为caspase-2的识别序列VDVAD linker的命名为CD2,中间蛋白酶的识别序列为caspase-3的识别序列DEVD linker的命名为CD3。2)将CD2和CD3探针分别表达于原核细胞E.Coli和真核细胞HeLa中,荧光光谱扫描和蛋白质免疫印迹杂交分析表明探针仅能被相对应的caspase蛋白酶切割,即CD2探针仅被caspase-2蛋白酶切割而不被其他的蛋白酶如caspase-3蛋白酶切割。从而证实探针构建正确,在体外体内均能正常工作,且特异性好。在本研究建立的三通道FRET成像系统上对活细胞内caspase-2和caspase-3蛋白酶的激活进行了实时动态的监测并绘制了相应的酶活动力学曲线。结果发现caspase-2的酶活动力学特征与效应caspase蛋白酶caspase-3明显不同。细胞凋亡中caspase-2的激活时间明显早于caspase-3,但持续时间较长,约30分钟,而caspase-3的完全激活在10分钟以内。该结果证实caspase-2具有起始caspase蛋白酶的激活特征,在细胞凋亡过程中的caspase级联系统中位于caspase-3的上游,是一种典型的起始caspase。3)比较了CD3和CY3两种探针在细胞凋亡中的稳定性,发现CD3探针在细胞凋亡中光稳定性明显优于CY3探针。光学性质稳定的CD3探针是进行TRAIL诱导的细胞凋亡路径研究的基本条件。研究发现TRAIL诱导的细胞凋亡中同时存在caspase-3依赖型和caspase-3非依赖型的凋亡路径。将TRAIL作用的HeLa细胞分为三类;第一类,caspase-3激活依赖型的凋亡细胞;第二类caspase-3激活非依赖型的凋亡细胞;第三类,没有发生凋亡的细胞。三类细胞所占的百分比分别是,第一类细胞为21.50%,第二类细胞为34.58%,第三类细胞为43.93%,也就是说发生凋亡的细胞总比例为56.08%。应用毛细管电泳技术,成功地检测了TRAIL作用下caspase-3蛋白酶的激活,对毛细管电泳图谱分析后发现caspase-3依赖型的细胞百分比为25.11%。该结果印证了基于FRET技术得出的结论。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 细胞凋亡概述
• 1.2 FRET 显微成像研究进展
• 1.3 选题背景及本文的研究内容
• 2 FRET 荧光探针的分子生物学构建
• 2.1 引言
• 2.2 试验材料
• 2.3 试验方法
• 2.4 FRET 探针的构建策略
• 2.5 结果
• 2.6 讨论
• 2.7 小结
• 3 实时在体监测 CASPASE-2 在活细胞内的激活
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 4.T RAIL 诱导下的细胞凋亡路径研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 总结及展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 1 在攻读博士学位期间发表的学术论文