肝癌microRNA稳定性、个体差异性与性别相关性评价

论文摘要

MicroRNA （miRNA）是一类长度约22 nt的非编码单链RNA,广泛存在于动物、植物中,具有基因表达调控的功能。研究表明,miRNA的异常表达与人类的各种癌症相关,且miRNA可作为肿瘤抑制基因或癌基因存在。当前许多研究集中在生理学或病理学过程miRNA表达的研究,血清中miRNA可作为检测各类癌症与疾病的潜在生物标记物用于病人外周血癌症的早期检测与癌症复发的检测。因此,有必要系统研究癌症相关血清中miRNA的稳定性。本研究的目的在于对不同形态的肝癌相关样本,包括肝癌Huh-7细胞系、临床肝癌组织和血液样本中的miRNA在不同条件下稳定性的评价。本研究使用18S rRNA作为对照基因,7种由相关文献报道的肝癌相关miRNAs（miRNA-21,-25,-29c,-93,-198,-221,-222）为目的基因。这些条件包括a)不同温度下（-80℃,-20℃,4℃,室温和37℃）放置3 h;b)在室温下放置0、1、3、6、12和24 h;c)37℃下RNase A处理0、3、6和12 h;d)37℃下DNase I处理0、3、6和12 h; e)不同冻融次数的处理（0、2、5、7和10次）;f)37℃下在不同pH（pH 1、6、7（对照）、9和13）温育3 h。处理后的样本经过40个循环的定量反转录聚合酶链式反应（Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ,qRT-PCR）进行测定。结果显示,在不同条件下肝癌相关miRNAs都有扩增,并且miRNA在极端苛刻的条件下能抵抗降解,保持稳定。而核糖体RNA（rRNA）较为脆弱,其相对扩增量在非生理测试中急剧下降,较易降解。以上数据在统计分析时p值小于0.05,具有统计学意义。以22例健康病人的血清样本为实验材料,利用qRT-PCR技术,以皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation coefficient）评估肝癌与miRNA表达量的关系。血清miRNA的表达水平在22例健康人血清样本中重复性好,R值接近1,p值小于0.05。该结果具有统计学意义。男性对女性血清miRNA相对表达量的皮尔逊相关性散点图显示R2为0.0953。结果说明miRNA的相对表达量与性别无关。本研究还比较了肝癌相关7种miRNAs在肝癌血清与健康血清中的表达量。结果显示,肝癌相关miRNAs在肝癌病人血清中的表达量显著高于在正常人血清中的表达量。即该7种miRNAs能特异区分肝癌血清与正常血清,可用作肝癌的生物标记物。从血清中较难分离RNA,且得到的RNA质量不高。因此,本研究建立了一种高效的血清RNA分离方法——预加热法。该方法对血清来源miRNA的研究十分关键。预加热法可将样本CT（threshold cycle）值降低至少5个循环。总之,本研究建立的高效血清RNA提取方法不仅有利于miRNA表达谱的研究,还有利于异常miRNA表达疾病预后的研究。综上所述,肝癌相关miRNAs（miR-21,-25,-29c,-93,-198,-221,-222）在血清中稳定存在且能被检测到;在同一物种不同个体的血清中重复性好;其表达量与性别不相关;能特异性区分肝癌血清与正常血清,可作为肝癌的潜在生物标记物。

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略语表

第1章文献综述

1 microRNA 概述

1.1 miRNA 的生物学特征及生物学功能

1.2 miRNA 的加工和作用机制

2 miRNA 稳定性研究进展

3 血清miRNA 与生物标记物

3.1 癌症生物标记物与miRNA

3.2 血清与外核体简介

3.3 血清肿瘤标记物研究历史

3.4 各类癌症相关生物标记物

3.5 miRNA 与妊娠相关疾病

4 肝癌miRNA 研究进展

5 研究肿瘤miRNA 的主要方法

5.1 分子杂交法

5.2 Real-time PCR

5.3 Solexa 测序

5.4 表面增强拉曼光谱法（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）

5.5 用荧光DNA 探针检测成熟miRNA

5.6 miRNA 潜在靶标的预测

第2章实验方案设计

1 研究目的和意义

2 研究主要内容

3 实验流程图

第3章材料与方法

1 材料

1.1 肝癌细胞系、组织与血清样本

1.2 主要仪器及材料

1.3 反转录茎环引物及PCR 引物

1.4 试剂及其来源

2 方法

2.1 血清样本制备

2.2 总RNA 样本制备

2.3 样本的处理

2.4 目标miRNA 的筛选

2.5 miRNA 茎环引物及PCR 引物设计

2.6 miRNA 表达的检测和分析

2.7 miRNA 表达的定量分析

第4章结果与分析

1 总RNA 样本的质量分析

2 加热预处理对血清RNA 提取效率影响分析

3 miRNA 在肝癌细胞系、组织和血清中表达的检测与分析

3.1 miRNA 基因的扩增（RT-PCR）

3.2 重组质粒PCR 鉴定

3.3 miRNA 基因的测序验证结果

3.4 引物特异性的验证与分析

4 RNA 的稳定性分析

4.1 Huh-7 细胞系中肝癌相关miRNA 的稳定性分析

4.2 肝肿瘤样本中肝癌相关miRNA 的稳定性分析

4.3 血清样本中肝癌相关miRNA 的稳定性分析

5 血清中miRNA 的表达个体差异性与性别的相关性

6 临床肝癌血清样本的检测分析

第5章讨论

1 miRNA 高效的分离方法

2 血清miRNA 的稳定性分析

3 基于荧光定量PCR 技术检测血清miRNA

4 miRNA 作为癌症的生物标记物

第6章总结与展望

1 总结

2 展望

参考文献

致谢

附录一重要试剂的配制

论文及专利发表、申请情况

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