论文摘要
研究背景：牙齿是一个特殊的器官，它由釉质、牙本质和牙髓组成。釉质位于最外层，是人体内最坚硬的组织。釉质包绕着另一层牙齿组织即牙本质。牙髓位于牙齿的中央，它包含有血管、神经以及其它的结缔组织。牙齿的发育开始于胚胎早期，两种不同的胚胎细胞——外胚层上皮源性的原始口腔上皮细胞和外胚层神经嵴源性的原始口腔间充质细胞相互作用指导牙齿的发育，决定它的结构、大小和类型。原始口腔上皮细胞分化成分泌釉质的成釉细胞，进而形成成釉器，最终形成釉质：原始口腔间充质细胞分化成分泌牙本质的成牙本质细胞，后来发育成为牙乳头和牙囊。最终，牙乳头形成牙本质和牙髓，牙囊形成牙骨质和其它附属组织。胚胎内部基因的激活控制着牙齿发育的整个程序。牙齿的替代在大多数非哺乳类脊椎动物遍及一生，而在大多数哺乳类脊椎动物只可替换一次。有些牙齿则完全没有被替换的可能，包括部分人类的牙齿和小鼠的牙齿。因此，如果这些牙齿受到腐蚀或者机械损伤，就可能造成永久性的不可修复的损伤。作为一门学科，组织工程学在15年前就已经诞生。她使用工程学的原理并结合人们对生物学的理解，运用生物科学的途径去再生新的组织。最近，随着牙齿发育生物学知识的积累、干细胞研究的发展、牙齿生物矿化原理理解的不断深入，结合组织工程方法和仿生学技术上的实践，为小孩或者成人牙齿萌出后成釉细胞的缺失以及牙齿釉质损伤的修复奠定了基础。虽然近年来的研究显示牙齿含有干细胞，然而受到细胞来源、增殖能力、分化潜能的限制，到目前为止不可能使用牙源性的干细胞来再生牙齿组织。因此，必须考虑一种新的具有可塑性的干细胞来源。已有研究证实，非牙源性的干细胞。比如骨髓源性干细胞，在适宜的环境下能够获得牙上皮细胞的特征。几十年前人们就已经证实皮肤组织内包含有表皮干细胞，它们负责表皮的修复和再生。最近，越来越多的研究表明表皮干细胞具有多向分化潜能和较强的可塑性，在适宜环境下可以分化成为多种类型细胞。皮肤和牙齿都是外胚层源性的器官，它们早期的发育都受到表皮—间充质交互作用机制的调节。所以，我们假设在适宜的环境下皮肤来源的表皮干细胞可能分化成为牙上皮，能够成为成釉细胞的一种来源。研究目的：本实验研究目的在于建立一种有效地传导胞间信号的诱导体系，将表皮干细胞诱导成为具有牙上皮特征的组织，实现组织工程化釉质的再生。研究方法：本研究在分离表皮干细胞的基础上，从体内诱导和体外诱导两个途径对表皮干细胞分化为牙上皮的可行性进行了研究。1)大鼠表皮干细胞的分离、培养与鉴定：使用鼠尾胶原快速黏附法分离新生大鼠的表皮干细胞，在无血清培养基（K-SFM）中进行培养。通过以下方法对表皮干细胞进行鉴定：记录生长情况，制作细胞生长曲线；免疫组化方法检测CK-19以及整合素-β1表达情况；流式细胞仪测定细胞周期；肾被膜下诱导观察分化情况。2)牙乳头组织诱导表皮干细胞分化及其结果鉴定：新生大鼠牙胚使用胰酶和胶原酶（1：1）处理后分离为牙上皮和牙乳头两部分。将分离后的牙乳头直接与PKH26标记的表皮干细胞重组作为实验组一。将牙上皮继续消化为单细胞，然后与PKH26标记过的表皮干细胞混合。将混合物的细胞成分离心处理，再与牙乳头重组作为试验组二。两种重组体在饱和湿度的CO2培养箱内培养48小时，随后移植入成年SD大鼠肾被膜下。在重组体植入后两周或者三周时，收集移植体。将移植体制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察荧光表达情况，结合H&E染色结果分析组织学变化。使用免疫组化的方法检测CK-14在重组体的表达。完整的全牙胚、单独的牙上皮以及单独的牙乳头分别作为对照组。3)牙胚细胞及其条件培养基诱导表皮干细胞分化及其结果鉴定：分离并培养新生大鼠第一磨牙全牙胚细胞，生长至60～70％汇合时，将其与表皮干细胞共培养进行诱导分化；或者采集全牙胚细胞的培养液，直接对表皮干细胞进行诱导分化。光镜下观察细胞形态变化，使用RT-PCR检测成釉蛋白（AMBN）和釉原蛋白（AMGN）mRNA的表达。牙上皮细胞和表皮干细胞分别做为对照组。研究结果：1)鼠尾胶原黏附法能够成功的分离表皮干细胞，这些细胞在K-SFM中能够良好扩增。CK-19以及整合素-β1免疫组化试验结果呈阳性。细胞周期分析81.2％的细胞在G0/G1期，显示细胞慢周期性。移植到肾被膜后能够分化，展现表皮样结构。说明分离到的细胞具有表皮干细胞特征。2)表皮干细胞与牙上皮细胞混合后再与牙乳头组织构建的重组体在肾被膜环境下能够良好的发育，具有正常牙齿的硬度和色泽。组织学分析显示重组体内有牙齿样的结构形成，其内部有明显的类釉质结构。类釉质结构能够释放PKH26的红色荧光，同时免疫组化显示CK-14呈阳性表达。说明表皮干细胞参与了类釉质结构的形成。但是，将单一的表皮干细胞与牙乳头重组时，没有齿样结构形成。3)与新生大鼠第一磨牙全牙胚细胞共培养后的表皮干细胞出现形态学的变化，细胞的形态变得更长，部分细胞呈簇状生长。免疫组化显示这些细胞中CK-14呈现阳性表达，显示细胞已经发生分化。AMBN mRNA和AMGN mRNA表达呈弱阳性。说明表皮干细胞在共培养状态下具有向牙上皮细胞分化的倾向。而使用牙胚细胞条件培养基诱导的试验组，细胞形态出现微弱的变化，在培养60h时细胞出现明显凋亡。结论：1)新生大鼠表皮干细胞具有一定的可塑性，在适宜诱导条件下可以分化形成类釉质结构。2)新生大鼠的牙乳头包含有一系列的信号分子，它们可以诱导表皮干细胞牙向分化。3)表皮干细胞与全牙胚细胞共培养时，能够诱导表皮干细胞向牙上皮细胞分化。