论文摘要
目的：卵巢恶性生殖细胞肿瘤（malignant ovarian germ cell tumor，MOGCT）是来源于胚胎性腺的恶性肿瘤，好发于儿童及青少年，患者往往有生育要求。该肿瘤手术联合术后化疗效果显著，但化疗后卵巢功能受损，严重影响患者的生存质量及生育功能。国内外学者均致力于研究对化疗所致卵巢功能损伤的保护方法，多项实验研究证实GnRH类似物对卵巢功能的保护作用效果确切，银杏黄酮抗氧化、抑制凋亡及对化疗药物耐药的逆转等作用也在多个实验中得到了验证，而氨磷汀作为细胞保护剂，其在放化疗过程中对于多个器官均显示保护作用，但其对卵巢的保护作用目前未见报道。MOGCT的常用化疗方案为BEP、EP、VIP方案，其中主要损伤卵巢功能的药物为顺铂。本实验使用大鼠作为卵巢功能损伤的模型，探讨银杏黄酮、氨磷汀及亮丙瑞林对化疗所致卵巢功能损伤的保护作用。上述三种药物在发挥卵巢功能保护作用的同时，是否影响顺铂的抗肿瘤作用，也是影响其临床应用的一个关键，本实验使用恶性畸胎瘤细胞PA-1作为恶性生殖细胞肿瘤的代表，探讨三种药物对顺铂的抗肿瘤作用的影响。方法：1顺铂所致卵巢功能损伤的大鼠模型的建立：通过大鼠E2及FSH水平的测定及卵巢卵泡计数确定造模的剂量和时间。2银杏黄酮、氨磷汀及亮丙瑞林对顺铂所致大鼠卵巢功能损伤的保护作用的研究：通过卵泡计数、称量卵巢重量、TUNEL法计算凋亡指数，Western-blot法检测胞浆Cyt-c及Apaf-1蛋白含量及实时定量PCR法检测胞浆Cyt-c及Apaf-1mRNA表达水平。3银杏黄酮、氨磷汀及亮丙瑞林对顺铂抑制PA-1细胞作用的影响的研究：CCK-8法检测细胞增殖抑制率，Western-blot法检测胞浆Cyt-c及Apaf-1蛋白含量，使用实时定量PCR法检测胞浆Cyt-c及Apaf-1mRNA表达水平。结果：1各组大鼠E2及FSH水平分别为：A组E273.87±13.95pg/ml， B组E272.03±6.74pg/ml， C组E265.17±5.43pg/ml，D组E243.17±6.78pg/ml，E组E232.80±2.46pg/ml，F组E228.60±2.78pg/ml，G组E222.37±2.91pg/ml，与A组相比，D组、E组、F组及G组E2下降，差异有统计学意义（P <0.05）；A组FSH1.07±0.15IU/L，B组FSH1.13±0.15IU/L，C组FSH1.30±0.26IU/L，D组FSH1.30±0.26IU/L，E组FSH2.20±0.36IU/L，F组FSH3.23±0.31IU/L，G组FSH4.13±0.40IU/L，与A组相比，E组、F组及G组FSH升高，差异有统计学意义（P <0.05）。综合卵泡计数情况，选取E组给药方案作为造模方案2给予银杏黄酮、氨磷汀及亮丙瑞林后各组大鼠卵泡计数：生理盐水组原始卵泡37.9±2.9个，生长卵泡24.3±1.3个，成熟卵泡13.2±1.3个，卵泡总数为75.4±3.1个。顺铂组原始卵泡35.2±4.0个，生长卵泡8.9±1.3个，成熟卵泡5.5±1.1个，卵泡总数为49.6±4.5个，各级卵泡及卵泡总数较生理盐水组少，差异有统计学意义（P <0.05）。银杏黄酮+顺铂组原始卵泡39.2±2.2个，生长卵泡13.6±1.3个，成熟卵泡9.2±1.1个，卵泡总数为60.5±3.9个，各级卵泡及卵泡总数较生理盐水组少，较顺铂组多，差异有统计学意义（P<0.05）。氨磷汀+顺铂组原始卵泡36.7±2.1个，生长卵泡15.8±2.1个，成熟卵泡11.3±2.0个，卵泡总数为63.8±5.1个，各级卵泡及卵泡总数较生理盐水组少，较顺铂组多，生长卵泡及成熟卵泡数量较银杏黄酮+顺铂组多，差异有统计学意义（P<0.05），原始卵泡及卵泡总数与银杏黄酮+顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。亮丙瑞林+顺铂组原始卵泡58.4±2.5个，生长卵泡6.4±1.0个，成熟卵泡2.7±2.2个，卵泡总数为67.7±3.5个，原始卵泡数量较其他四组多，生长卵泡及成熟卵泡较其他四组少，卵泡总数较生理盐水组少，较顺铂组、银杏黄酮+顺铂组及氨磷汀+顺铂组多，差异有统计学意义（P<0.05）。3各组卵巢凋亡指数的结果：生理盐水组凋亡指数为3.6±0.7。顺铂组凋亡指数为65.3±2.9，明显高于生理盐水组，差异有统计学意义（P<0.05）。银杏黄酮+顺铂组凋亡指数为35.7±2.0，高于生理盐水组，低于顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。氨磷汀+顺铂组凋亡指数为37.4±1.6，高于生理盐水组，低于顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05），与银杏黄酮+顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。亮丙瑞林+顺铂组凋亡指数为30.5±2.9，高于生理盐水组，低于顺铂组、银杏黄酮+顺铂组及氨磷汀+顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。4各组卵巢胞浆Cyt-c及Apaf-1蛋白的含量顺铂组较生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05）。银杏黄酮+顺铂组，较生理盐水组高，较顺铂组低，差异有统计学意义（P<0.05）。氨磷汀+顺铂组含量较生理盐水组高，较顺铂组低，差异有统计学意义（P<0.05）。与银杏黄酮+顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。亮丙瑞林+顺铂组与生理盐水组比较差异无统计学意义（P>0.05），较顺铂组、银杏黄酮+顺铂组及氨磷汀+顺铂组低，差异有统计学意义（P<0.05）。5各组卵巢胞浆Cyt-c及Apaf-1mRNA的含量顺铂组表达高于生理盐水组，差异有统计学意义（P<0.05）。银杏黄酮+顺铂组表达低于生理盐水组及顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。氨磷汀+顺铂组表达低于生理盐水组、顺铂组及银杏黄酮+顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。亮丙瑞林+顺铂组表达与生理盐水组比较差异无统计学意义，较顺铂组低，较银杏黄酮+顺铂组及氨磷汀+顺铂组高，差异有统计学意义（P<0.05）。6各组PA-1细胞增殖抑制率：生理盐水组增殖抑制率为0，顺铂组增殖抑制率为44.7%，银杏黄酮+顺铂组增殖抑制率为56.3%，高于顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。氨磷汀+顺铂组增殖抑制率为64.0%，高于顺铂组及银杏黄酮+顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。亮丙瑞林+顺铂组增殖抑制率为61.5%，高于顺铂组及银杏黄酮+顺铂组，低于氨磷汀+顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。7各组PA-1细胞胞浆Cyt-c蛋白的含量顺铂组含量为1.56±0.09，较生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05）。银杏黄酮+顺铂组含量为1.87±0.03，较生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05）。与顺铂组比较差异无统计学意义（P>0.05），氨磷汀+顺铂组含量为2.91±0.07，较生理盐水组、顺铂组及银杏黄酮+顺铂组高，差异有统计学意义（P<0.05）。亮丙瑞林+顺铂组含量为2.31±0.05，较生理盐水组、顺铂组及银杏黄酮+顺铂组高，较氨磷汀+顺铂组低差异有统计学意义（P<0.05）。8各组PA-1细胞胞浆Apaf-1蛋白的含量顺铂组含量为1.72±0.09，较生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05）。银杏黄酮+顺铂组含量为2.66±0.10，较生理盐水组及顺铂组高，差异有统计学意义（P<0.05）。氨磷汀+顺铂组含量为4.35±0.30，较生理盐水组、顺铂组及银杏黄酮+顺铂组高，差异有统计学意义（P<0.05）。亮丙瑞林+顺铂组含量为2.46±0.17，较生理盐水组及顺铂组高，较氨磷汀+顺铂组低，差异有统计学意义（P<0.05），与银杏黄酮+顺铂组比较差异无统计学意义（P>0.05）。9各组PA-1细胞胞浆Cyt-c mRNA的含量顺铂组表达为生理盐水组的2.23±0.45倍，银杏黄酮+顺铂组表达为生理盐水组的3.64±0.35倍，氨磷汀+顺铂组表达为生理盐水组的7.56±0.66倍，亮丙瑞林+顺铂组表达为生理盐水组的4.22±0.42倍，各组间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。10各组PA-1细胞胞浆Apaf-1mRNA的含量顺铂组表达为生理盐水组的1.91±0.23倍，较生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05）。银杏黄酮+顺铂组表达为生理盐水组的2.72±0.45倍，较生理盐水组高，差异有统计学意义（P<0.05），与顺铂组相比差异无统计学意义（P>0.05）。氨磷汀+顺铂组表达为生理盐水组的5.77±0.45倍，较生理盐水组、顺铂组及银杏黄酮+顺铂组高，差异有统计学意义（P<0.05）。亮丙瑞林+顺铂组表达为生理盐水组的3.07±0.34倍，较生理盐水组及顺铂组高，较氨磷汀组低，差异有统计学意义（P<0.05）。与银杏黄酮+顺铂组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1顺铂对大鼠卵巢功能损伤作用明显，2mg/（kg·d）腹腔注射7天可获得满意的卵巢功能损伤大鼠动物模型。2顺铂腹腔注射前给予银杏黄酮、氨磷汀及亮丙瑞林、对顺铂所致大鼠卵巢功能损伤有一定的保护作用，且亮丙瑞林作用优于银杏黄酮及氨磷汀，银杏黄酮与氨磷汀的作用相当。3顺铂对体外培养的PA-1细胞有明显抑制作用，给予顺铂前给予银杏黄酮、氨磷汀及亮丙瑞林，不减弱顺铂对PA-1的抑制作用，反而有加强作用，可上调Cyt-c和Apaf-1mRNA的表达水平及提高胞浆内Cyt-c和Apaf-1蛋白含量。三者比较以氨磷汀作用最强，亮丙瑞林次之，银杏黄酮最弱。