论文摘要
糖多孢红霉菌（Saccharopolyspora erythraea）是一类能形成菌丝体的放线菌,它被用于红霉素A的工业化生产。近年来人们研究发现具有生物活性的次级代谢产物的合成受到复杂调控网络的控制,而对这种复杂调控网络进行改造是一项能提高多种工业化合物的重要策略。糖多孢红霉菌合成红霉素的过程已很清晰,但对其调控机制研究很少,迄今只报道了BldD因子对糖多孢红霉菌形态分化和红霉素合成的调控作用。TetR家族是一类广泛存在于细菌中的转录调控因子,调控着众多的细胞活动。近年来在对链霉菌TetR家族研究中,发现了多种调控抗生素合成的TetR家族转录调控因子,有的调控因子还同时影响菌株的形态分化。根据糖多孢红霉菌全基因组测序结果分析,属于TetR家族的调控因子有101个,然而它们的生物功能至今尚未有报道。本研究通过对四个TetR家族基因的阻断进而筛选对糖多孢红霉菌形态分化或红霉素合成有调控作用的基因,并通过在bldD突变体中阻断SACE7040构建bldD和SACE7040的双突变体来研究两者之间的功能关系。本研究首先通过片段同源重组的方法构建SACE0012、SACE0820、SACE1255和SACE1632基因失活突变体。用PCR技术分别扩增这四个基因两侧约1500bp的上下游同源片段,将每个基因的上下游同源片段依次连接到硫链丝菌肽抗性基因（thiostrepton resistance gene, tsr）的两端。构建好的含有阻断基因上下游同源片段的片段转入糖多孢红霉菌A226原生质体中,上下游同源臂与基因组中相应的片段进行同源重组从而将要阻断的基因替换为tsr抗性基因,构建了ΔSACE0012,ΔSACE0820,ΔSACE1255,ΔSACE1632四个突变体。将这些突变体和糖多孢红霉菌A226接种到R3M大斜面上30℃恒温培养,观察其气生菌丝和孢子的生长；同时接种到TSB液体培养基中发酵1周,通过抑菌活性实验检测红霉素合成量的变化。结果显示,ΔSACE0012突变体较A226出发菌株提前至少12小时形成孢子,但红霉素的合成量与A226相比没有明显变化。ΔSACE0012,ΔSACE0820,ΔSACE1255,ΔSACE1632形态分化和红霉素合成量与A226基本一致,没有明显的变化,初步推测ΔSACE0012对糖多孢红霉菌的形态分化有一定的负调控作用。本实验室之前通过对TetR家族基因SACE7040的研究,发现SACE7040负调控糖多孢红霉菌的形态分化。为了探讨调控糖多孢红霉菌形态分化基因之间的关系,本研究进行了从AbldD突变体中分别敲除SACE0012和SACE7040基因的实验,通过片段同源重组的方法构建了ΔbldD/ΔSACE 0012和ΔbldD/ΔSACE7040双突变体。将ΔbldD/ΔSACE0012、ΔbldD/ΔSACE7040、ΔbldD和糖多孢红霉菌A226分别同时接种到R3M大斜面和平板上,然后将接种的大斜面和平板置于30℃培养,观察突变菌株与A226的孢子生长情况,结果发现ΔbldD/ΔSACE0012突变株与ΔbldD表型一样,而ΔbldD/ΔSACE7040突变株在培养2天后,菌落表面成白色说明生成了气生菌丝,初步证明了SACE7040与bldD之间有一定的关联。为了进一步验证SACE7040与bldD之间的关联,本研究还对ΔbldD/ΔSACE 7040双突变体进行了回复实验。将含有SACE7040基因的pZMW-7040质粒和pZMW质粒分别转入ΔbldD/ΔSACE7040原生质体中,构建回复菌株ΔbldD/ΔSACE7040/pZMW-7040和对照ΔbldD/ΔSACE7040/pZMW。将ΔbldD/ΔSACE7040/pZMW-7040、ΔbldD/ΔSACE7040/pZMW、AbldD、ΔbldD/ΔSACE7040（?）口糖多孢红霉菌A226分别同时接种到R3M平板上,然后将接种的平板置于30℃培养观察孢子生长情况。结果发现ΔbldD/ΔSACE7040/pZMW-7040回复菌株表型基本与ΔbldD一致,转入空质粒的ΔbldD/ΔSACE7040/pZMW表型没有发生变化,进一步说明了SACE7040与bldD之间的关联性。本研究为理解糖多孢红霉菌形态分化调控机制开启了一个新的起点,并且随着糖多孢红霉菌基因组测序完成,使得我们能够对其基因功能进行鉴定,因此将会发现更多重要的控制红霉素生物合成和形态分化的调控因子。