大黄鱼TLR途径中部分基因的克隆与特征分析

论文摘要

大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国养殖量最大的海水经济鱼种之一，近年来其病害频发造成的经济损失十分严重。加强对大黄鱼免疫学理论的基础研究，了解其抗病免疫机制，提升防病技术，对于大黄鱼养殖业十分重要。本研究利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼TLR3、TLR5S、TLR5M、IRF3、IRAK4和IL-1β基因的全长cDNA序列以及部分基因的基因组序列，分析了它们的分子结构，并利用荧光定量PCR技术研究了它们在大黄鱼不同组织的表达谱，以及溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）和病原模式分子LPS、poly I:C免疫刺激后脾脏、血液和肝脏中这些基因在转录水平的表达变化，结果如下：（1）TLR3全长cDNA序列3384bp，5’UTR为65bp，ORF为2730bp，3’UTR为589bp，编码909个氨基酸，有三个主要的结构域，即LRRs、跨膜区和TIR结构域。TLR3基因组包含5个外显子和4个内含子。TLR3在大黄鱼的大部分组织中都有表达，其中在肝脏中的表达量较高，血液中表达量较低；poly I:C刺激可以诱导TLR3基因在脾脏、血液和肝脏中表达量增加，而LPS和弧菌刺激能诱导血液中TLR3mRNA水平的表达量上调，但是肝脏中的TLR3转录表达下调。（2）TLR5S基因全长cDNA序列2286bp，ORF为1929bp，编码642个氨基酸，基因组包含2个外显子和1个内含子；TLR5M基因全长cDNA序列3285bp，ORF为2658bp，编码885个氨基酸，基因组包含4个外显子和3个内含子；TLR5S仅含有LRRs结构域，而TLR5M含有LRRs、跨膜区和TIR三个结构域。组织表达分析发现，TLR5S和TLR5M在大部分组织中都有表达，TLR5S在肝脏中表达量较高而TLR5M在心脏中表达量较高；LPS刺激后TLR5M在脾脏、肝脏与血液中的表达量均上调，而TLR5S仅在脾脏和肝脏中的表达量上调；弧菌刺激后3h TLR5M基因在脾脏中的表达量显著低于对照组，而弧菌刺激后12h和48h TLR5S基因在肝脏中的表达量显著低于对照组。（3）IRF3基因全长cDNA序列2204bp，ORF为1389bp，编码462个氨基酸，含有一个IRF结构域。定量PCR分析发现：IRF3在大部分组织中都有表达，在肝脏中表达量较高；LPS和poly I:C刺激都可以诱导脾脏、血液和肝脏三个组织中IRF3转录表达变化。（4）IRAK4基因全长cDNA序列1817bp，ORF为1398bp，编码465个氨基酸，含有DD和STKc两个结构域。组织表达分析发现，IRAK4在大部分组织中都有表达，其中在肝脏中表达量较高；LPS和poly I:C刺激诱导IRAK4基因在脾脏和血液中的表达量上调，而在肝脏中的表达量下调，弧菌刺激后脾脏和血液中IRAK4基因的表达量下降。（5）IL-1β基因全长cDNA序列1295bp，ORF为768bp，编码255个氨基酸，含有一个IL-1结构域。IL-1β基因组包含5个外显子和4个内含子。定量PCR分析发现：IL-1β在所检测的组织中都有表达，在肝脏中表达量最高；LPS、poly I:C和弧菌刺激后24h血液和肝脏中IL-1β基因的表达量都显著低于对照组，而脾脏中poly I:C刺激后6h、12h及血液中poly I:C刺激后3h、6h、48h IL-1β基因的表达量都显著高于对照组。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 大黄鱼概况
• 1.1.1 经济价值
• 1.1.2 主要病害
• 1.2 鱼类 TLR 家族及其功能研究进展
• 1.2.1 鱼类的免疫系统
• 1.2.2 TLR 信号传导通路研究进展
• 1.3 本研究的目的及意义
• 第2章 大黄鱼 TLR 途径中部分基因的 CDNA 序列克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 总 RNA 提取结果
• 2.2.2 大黄鱼 TLR3 基因全长 cDNA 序列
• 2.2.3 大黄鱼 TLR5S 基因全长 cDNA 序列
• 2.2.4 大黄鱼 TLR5M 基因全长 cDNA 序列
• 2.2.5 大黄鱼 IRF3 基因全长 cDNA 序列
• 2.2.6 大黄鱼 IRAK4 基因全长 cDNA 序列
• 2.2.7 大黄鱼 IL-1β基因全长 cDNA 序列
• 2.3 讨论
• 2.3.1 大黄鱼 TLR3 基因
• 2.3.2 大黄鱼 TLR5 基因
• 2.3.3 大黄鱼 IRF3 基因
• 2.3.4 大黄鱼 IRAK4 基因
• 2.3.5 大黄鱼 IL-1β基因
• 第3章 大黄鱼 TLR 途径中部分基因的基因组序列及 5’侧翼序列的扩增
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 大黄鱼 TLR3 基因的基因组序列
• 3.2.2 大黄鱼 TLR5S 基因的基因组序列
• 3.3.3 大黄鱼 TLR5M 基因的基因组序列
• 3.3.4 大黄鱼 IL-1β基因的基因组序列
• 3.3.5 大黄鱼 MyD88 基因的基因组序列
• 3.3.6 大黄鱼 TLR9 基因的基因组序列
• 3.3 讨论
• 第4章 免疫刺激后大黄鱼 TLR 途径中部分基因的表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 cDNA 第一条链反转录效果的检测
• 4.2.2 目的基因 Real-time PCR 引物特异性的检测结果
• 4.2.3 熔解曲线分析
• 4.2.4 大黄鱼 TLR3 基因表达结果
• 4.2.5 大黄鱼 TLR5S 基因表达结果
• 4.2.6 大黄鱼 TLR5M 基因表达结果
• 4.2.7 大黄鱼 IRF3 基因表达结果
• 4.2.8 大黄鱼 IRAK4 基因表达结果
• 4.2.9 大黄鱼 IL-1β基因表达结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 TLR3 基因的组织表达谱及免疫刺激后的表达变化
• 4.3.2 TLR5 基因的组织表达谱及免疫刺激后的表达变化
• 4.3.3 IRF3 基因的组织表达谱及免疫刺激后的表达变化
• 4.3.4 IRAK4 基因的组织表达谱及免疫刺激后的表达变化
• 4.3.5 IL-1β基因的组织表达谱及免疫刺激后的表达变化
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文