白英水提取液诱导人大肠癌HT29细胞凋亡及其机制研究

论文摘要

目的：1、探讨白英水提取液诱导人大肠癌HT29细胞凋亡的机制。2、探讨白英水提取液对Notch1基因的影响。方法：1、取白英全草干品浸泡、煎熬、过滤、浓缩,获取白英水提取液。2、体外培养人大肠癌HT29细胞,实验随机分为正常对照组、白英处理组（浓度分别为1.25、2.5、5mg/mL）和阳性对照组（羟基喜树碱浓度为10μg/mL）。3、白英水提取液分别作用人大肠癌HT29细胞24h、48h和72h后,采用细胞毒（MTT法）实验检测OD值,计算对照组和各实验组人大肠癌HT29细胞的抑制率和IC50值。4、不同浓度的药物处理24h后,用光学显微镜和电镜观察细胞形态变化。5、不同浓度的药物处理24h后,应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。6、不同浓度的药物处理24h后,半定量RT-PCR法检测caspase-8、Notch1 mRNA的表达。结果：1、MTT检测结果表明白英水提取液各浓度组人大肠癌HT29细胞增殖抑制率显著升高,且呈一定的剂量和时间依赖性。浓度分别为1.25、2.5、5mg/mL的白英水提取液和浓度为10μg/mL的羟基喜树碱处理人大肠癌HT29细胞24h,细胞抑制率分别为（14.08±3.02）%、（35.98±3.62）%、（59.18±5.84）%和（52.90±5.05）%；处理48h,细胞抑制率分别为（24.09±3.90）%、（57.15±3.99）%、（78.95±5.70）%和（71.61±5.32）%；处理72h,细胞抑制率分别为（45.61±6.22）%、（70.05±2.46）%、（89.23±2.14）%和（87.83±2.01）%；白英水提取液处理大肠癌HT29细胞24h、48h和72h的IC50分别为3.83、2.29和1.42mg/mL。2、光镜下可见,在加入白英水提取液和羟基喜树碱后,细胞增殖减慢,出现皱缩、脱壁、漂浮现象。电镜下可见白英处理组细胞体积缩小,核染色质凝聚、边集,出现核碎片、凋亡小体等细胞凋亡现象。3、流式细胞仪检测结果显示,正常对照组人大肠癌HT29细胞凋亡率为（3.43±0.40）%,白英水提取液各浓度组与羟基喜树碱组HT29细胞凋亡率分别为（9.14±1.59）%,（21.55±2.03）%,（40.10±2.53）%和（39.67±2.82）%,与正常对照组相比有显著性差异（P<0.01）,且呈明显的剂量效应关系。4、半定量RT-PCR检测结果显示,随着白英水提取液浓度的升高,caspase-8 mRNA表达上调,Notch 1 mRNA表达下调。1.25、2.5、5mg/mL白英处理组caspase-8/β-actin光密度积分值之比分别0.382±0.023、0.545±0.045和0.723±0.015,与正常对照组0.204±0.043相比有显著差异（P<0.001）Notch1/β-actin光密度积分值之比分别为0.518±0.019、0.437±0.024和0.239±0.041,与正常对照组0.648±0.019相比有显著差异（P<0.01或P<0.001）。结论：1、白英水提取液对人大肠癌HT29细胞增殖有较强的抑制作用,且这种作用呈一定的剂量和时间依赖性。2、白英水提取液具有诱导人大肠癌HT29细胞凋亡的作用,且细胞凋亡率呈明显的剂量效应关系。诱导细胞凋亡可能是白英水提取液抗肿瘤作用的机制之一。3、白英水提取液能上调caspase-8基因的mRNA水平,其诱导人大肠癌HT29细胞凋亡可能与死亡受体通路有关。4、白英水提取液能下调Notch 1基因的mRNA水平,提示白英水提取液可能通过影响Notch信号途径从而抑制人大肠癌HT29细胞的增殖,促进细胞凋亡

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要溶液配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 白英水提取液的制备
• 2.2.2 细胞复苏、传代和冻存
• 2.2.3 实验分组
• 2.2.4 绘制人大肠癌HT29细胞生长曲线（细胞计数法）
• 2.2.5 MTT法检测细胞的增殖
• 2.2.6 细胞形态学变化
• 2.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测人大肠癌HT29细胞凋亡
• 2.2.8 半定量RT-PCR检测Notch1、caspase-8基因的表达变化
• 2.2.9 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 人大肠癌HT29细胞生长曲线
• 3.2 白英水提取液对人大肠癌HT29细胞的生长抑制作用
• 3.3 细胞形态学变化
• 3.3.1 光镜
• 3.3.2 电镜
• 3.4 流式细胞仪检测白英水提取液对人大肠癌HT29细胞凋亡的影响
• 3.5 半定量RT-PCR检测基因caspase-8、Notch1的表达变化
• 第4章 讨论
• 4.1 白英水提取液对人大肠癌细胞增殖的影响
• 4.2 白英水提取液对人大肠癌细胞形态的影响
• 4.3 白英水提取液对人大肠癌细胞凋亡的影响
• 4.4 白英水提取液对人大肠癌细胞凋亡相关因子caspase-8基因表达的影响
• 4.5 白英水提取液对人大肠癌细胞Notch1基因表达的影响
• 4.6 白英的抗肿瘤作用及引起细胞凋亡的可能机制
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献