白藜芦醇对亚急性衰老雄性小鼠生殖功能的影响

论文摘要

衰老（senescence or aging）是一个随着年龄的增长而逐渐发生组织细胞老化,器官功能不可避免的生理过程。衰老的明确机制尚不十分清楚。长期以来,世界各地的抗衰老学者做了大量工作,也提出了许许多多的学说。比如：氧自由基学说,细胞衰老学说,神经内分泌免疫学说等等。在这些学说中,氧自由基学说得到了大多数学者的肯定和认可。D-半乳糖（D-galactose, D-gal）致衰老模型是我国学者徐黻本最早于1985年提出的一种衰老模型。目前已经广泛的应用于复制脑老化,白内障,生殖衰老等动物模型。随着世界人口老龄化的到来,探索人类衰老的机理,延缓衰老的发生,提高老年人的生命质量,己成为广泛关注的重要科学课题。我们也是应用这个模型制作亚急性小鼠衰老模型来观察小鼠睾丸和精子的衰老变化,探讨和完善生殖衰老的机理,研究白藜芦醇（resveratrol, RES）延缓生殖衰老的作用机制,从而为白藜芦醇抗衰老研究提供更多的实验依据。Ⅰ目的：观察D-半乳糖（D-gal）所致亚急性小鼠衰老模型中生殖衰老变化和白藜芦醇处理后的变化。Ⅱ方法：选用3-4月龄体重为（25±2g）的C57/6J小鼠36只（购置南方医科大学实验动物中心）,随机分为六组,每组六只：生理盐水组,衰老模型组,溶剂对照组,高剂量白藜芦醇组,低剂量白藜芦醇组,阳性对照组。（1）衰老模型的建立及药物处理：①生理盐水组（NS）：给予皮下注射生理盐水8周,2周后给予生理盐水灌胃6周；②模型组（D-gal）给予皮下注射D-ga18周,2周后给予生理盐水灌胃6周；③溶剂对照组（DMSO）:给予皮下注射D-ga18周,2周后给予DMSO灌胃6周；④高剂量白藜芦醇组（RES-H）:给予皮下注射D-ga18周,2周后给予RES-H灌胃6周；⑤低剂量白藜芦醇组（RES-L）:给予皮下注射D-gal8周,2周后给予RES-L灌胃6周；⑥阳性对照组（VC）：给予皮下注射D-gal8周,2周后给予VC灌胃6周。并观察实验小鼠体重,毛色,和一般情况。（2）小鼠眼球取血后取上清,分别检测：①分别采用黄嘌呤氧化酶法和TBA法分别检测小鼠血清SOD活力和MDA的量；②采用酶联免疫法（ELISA）检测小鼠血清睾酮。（3）小鼠睾丸石蜡切片HE染色以及P53免疫组化染色：小鼠一部分睾丸取材后经4%多聚甲醛固定好,常规脱水,透明,浸蜡,包埋,切片后HE染色观察睾丸生精小管形态结构变化；SABC免疫组化法检测睾丸生精细胞P53表达的变化情况。（4）小鼠精子质量测定：小鼠附睾一部分精子用37度预温的生理盐水小心制备成精子悬液,并制作精子涂片。然后分别用伊红染色检测精子活率；镜下观察精力活力；计数精子数量计算密度；HE然染色检测精子形态（畸形率）。（5）小鼠睾丸石蜡切片睾丸生精细胞凋亡（TUNEL）测定：严格按实际和说明书进行操作。Ⅲ结果：（1）小鼠体重,毛色及一般情况变化：D-gal组及DMSO组小鼠比NS组体重增长慢,毛色逐渐失去光泽,发黄甚至发白,有些小鼠还出现掉毛情况,一般情况也较差：精神较萎靡,活动减少,进食饮水少；RES-H组和VC组小鼠则和NS组相似,比起D-gal组及DMSO组来,体重毛色和一般情况为好,上述衰老征象得到一定程度改善；而RES-L组小鼠体重毛色和一般情况变化介于D-gal组和RES-H组之间,即衰老征象轻于D-gal组而重于RES-H组和VC组。（2）小鼠血清睾酮（T）, SOD活力和MDA的量变化：小鼠血清SOD活力和睾酮（T）含量：RES-L组小鼠血清睾酮水平与D-gal组小鼠相比无明显改变（P>0.05）, D-gal组低于NS组（P<0.05）,而RES-H可提高模型小鼠血清睾酮含量（RES-H组与D-gal组比较,P<0.05）。小鼠血清MDA的量：D-gal组高于NS组和RES-H组,而VC组和RES-L组之间无明显差异（P>0.05）。（3）小鼠睾丸石蜡切片HE染色：光镜下观察可见D-gal组生精小管部分基膜增厚、不完整,生精小管内生殖细胞减少,排列稀疏。RES-L组小鼠睾丸生精小管的形态结构与D-gal小鼠相比无明显改善,RES-H灌胃后,睾丸生精小管的形态结构较D-gal组小鼠有所恢复,基膜趋于完整,生精细胞层数增多,但与正常小鼠的睾丸相比,生精细胞较稀疏。（4）小鼠睾丸石蜡切片P53免疫组化染色：p53阳性细胞主要是精原细胞,阳性产物位于细胞核,D-gal组p53阳性细胞率高于NS组（P<0.01）, RES-H组小鼠P53阳性细胞率则低于D-gal组（P<0.01）,而VC组和RES-L组之间无明显差异（P>0.05）。D-gal组P53阳性细胞率均比NS组升高（P<0.01）。RES-H组小鼠P53阳性率低于D-gal组（P<0.01）。（5）小鼠精子质量变化：D-gal组小鼠精子质量低于NS组（P<0.05）,这说明衰老可以引起小鼠精子质量的全面下降,包括降低精子密度,活力,活率,增高畸形率；RES-H组小鼠精子密度,活率及活力均高于D-gal组（P<0.05）,这说明RES-H可以提高衰老小鼠精子质量；VC组小鼠精子活力低于于NS组和RES-H组而和D-gal组,DMSO组RES-L组差异不大,说明VC和RES-L不能很好的增高衰老小鼠精子活力。（6）小鼠睾丸石蜡切片生精细胞凋亡（TUNEL）测定：各组小鼠凋亡率存在差异,D-gal组小鼠生精细胞凋亡率低于NS组（P<0.01）,这说明生殖器官的衰老生精细胞的凋亡是增加的,RES-H组小鼠生精细胞凋亡率低于D-gal组（P<0.05）,这说明RES可以改善衰老所致生精细胞的凋亡。Ⅳ讨论我们在实验过程中成功地建立了D-半乳糖致亚急性小鼠衰老模型并主要观察了D-半乳糖模型下小鼠体重毛色和一般情况以及生小鼠殖器官的衰老变化和加用RES后小鼠衰老征象和形态生化等变化情况,得出以下结论：（1）D-半乳糖模型小鼠衰老征象：小鼠毛色变黄和一般情况变差；自由基产生增多,脂质过氧化物堆积,抗氧化能力下降；小鼠睾丸和精子形态结构改变并且超微结构明显也改变；血清睾酮含量下降,生精小管结构紊乱,生精细胞增殖能力下降,生精细胞凋亡增加,p53基因表达水平增高,从而使睾丸生精功能减退,进而使得衰老小鼠生殖功能下降。（2）RES可通过提高血清SOD活力,降低血清MDA的量来提高机体的抗氧化能力；还可以提高血清睾酮含量降低睾丸生精细胞P53的表达水平,降低睾丸生精细胞的凋亡指数来改善衰老所致的生精功能下降。因此本实验表明RES具有良好的延缓衰老的作用,可以提高机体抗氧化能力、改善睾丸内分泌细胞的功能、促进生精功能的恢复、延缓性腺机能的衰退。（3）RES可以改善衰老雄性小鼠精子质量（如增加精子密度,活率和活力；并减少畸形精子比率等）,并改善主要生殖器官（睾丸）的生精上皮结构和功能从而改善衰老机体生殖功能。（4）RES可能通过下调P53基因的表达来减轻衰老机体生殖器官,特别是生精细胞的凋亡,从而在一定程度上起到抗生殖衰老的作用。综上所述,我们的研究发现D-半乳糖致衰老小鼠的外观,毛色和一般情况,睾丸组织和生精细胞形态以及血清生化指标均发生了一系列衰老变化,并通过实验证实了RES具有明显的延缓衰老的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一、前言
• 二、材料与方法
• 2.1 主要试剂及配置
• 2.2 主要仪器
• 2.3 方法
• 三、结果
• 3.1 亚急性衰老小鼠的观察
• 3.2 小鼠睾丸指数测定
• 3.3 小鼠血清SOD,MDA和睾酮（T）测定
• 3.4 小鼠精子质量测定结果
• 3.5 各组小鼠睾丸石蜡切片HE染色
• 3.6 小鼠睾丸石蜡切片生精细胞P53免疫组化染色和凋亡检测（TUNEL）
• 四、讨论
• 4.1 衰老模型的评价以及睾丸组织细胞形态学变化
• 4.2 RES对小鼠抗氧化能力的影响
• 4.3 RES对小鼠精子质量和睾酮（T）的影响
• 4.4 RES对小鼠生精细胞P53表达和生精细胞凋亡的影响
• 4.5 小结
• 4.6 参考文献
• 攻读学位期间成果
• 附图和附表
• 缩略词一览表
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 统计学证明