小麦旗叶衰老相关基因表达图谱的初步研究

论文摘要

小麦是世界上重要的粮食作物,也是我国的三大粮食作物之一。随着人口的增长和土地资源的减少,小麦产量的年增长率已低于其消费的增长率,所以,在小麦育种中进一步提高小麦的产量和改善品质非常重要。叶片的衰老（特别是旗叶的早衰）是限制产量的重要因素之一。小麦旗叶的衰老与其籽粒形成和灌浆成熟同步进行,旗叶的过早衰老会严重影响小麦产量,而推迟旗叶衰老的发生、延缓其衰老的进程可以显著提高小麦产量并改善籽粒品质。河北师范大学和栾城县原种场合作培育的优质、强筋冬小麦品种“师栾02-1”在国内已有了较大的推广种植面积,但是,该品种在生育后期叶片有早衰现象,在一定程度上影响了产量的进一步提高。本研究以田间栽培小麦“师栾02-1”为材料,从与小麦产量密切相关的旗叶入手,通过基因芯片技术分析衰老与非衰老小麦旗叶在转录水平上的差异,分离鉴定与小麦旗叶衰老相关的EST,为深入探讨小麦叶片衰老调控机理奠定基础。取田间栽培小麦“师栾02-1”四个不同发育时期（S1,叶面积为成熟叶片面积一半的叶片；S2,成熟叶片；S3,衰老面积小于10%的叶片；S4,衰老面积约为50%的叶片）的旗叶,提取RNA,分离纯化mRNA,采用Affymetrix公司生产的小麦基因芯片,进行表达谱分析。以小麦61115个非重复序列做杂交位点,经ANOVA分析表达量差异在两倍以上的视为差异有意义,在此基础上进一步数据分析得到,S2,S3,S4和S1相比,表达差异倍数均在两倍以上的有1151个EST,S2和S1,S3和S2,S4和S3相比,表达差异倍数均在两倍以上的有306个EST。根据NCBI、CerealsDB等数据库信息,我们对所有表达量差异在两倍以上的杂交点的蛋白类型进行了信息注释、分析和功能预测,发现表达上调的基因中有很多是和衰老密切相关的基因,它们参与了叶绿素降解、核酸降解、蛋白质降解、碳水化合物代谢、信号转导、胁迫防御、营养转运等过程,其中包括已知在叶片衰老中发挥重要作用的WRKY、NAC、MYB等衰老相关转录因子和MRPK、PP2C等。我们又对所有的注释信息用聚类分析的方法进行了分类,从聚类（层次聚类,complete linkage）图谱上看,大致可以把这些分为3类或6类。采用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因芯片数据分析得到的一部分转录因子相对表达量进行了分析,发现所选转录因子随着旗叶衰老进程的进行其基因表达量也逐渐增强。实时荧光定量PCR的结果得到的候选基因的表达趋势与基因芯片数据一致,证明了基因芯片数据的准确性与可靠性。MicroRNA广泛存在于植物、昆虫及哺乳动物中,能够与目标mRNA分子互补配对从而导致该mRNA分子的翻译受到抑制或降解,在生物的生长发育中起着非常重要的调控作用。本研究从CBIPKU、miRBase、PMRD等microRNA数据库中找出一些与基因芯片数据中转录因子所对应的microRNA,选取其中一部分利用颈环引物定量PCR法做进一步的研究。证明了在叶片的四个不同生理时期microRNA的表达趋势与芯片的数据是相符的,从而再一次验证了基因芯片数据的准确性与可靠性。microRNA分析结果也进一步说明microRNA在叶片衰老的调控过程中发挥重要作用。总之,本研究以田间栽培小麦四个不同发育时期的旗叶为材料制作表达谱芯片,分析了衰老与非衰老小麦旗叶在基因转录水平上的差异,得到了一些与叶片衰老相关的EST,通过采用实时荧光定量RT-PCR的方法和从microRNA的表达模式两个方面来验证基因芯片的结论,得到的衰老相关转录因子和microRNA在叶片衰老调控中可能发挥重要作用,它们的具体功能值得进一步深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 小麦叶片衰老机制的研究进展
• 1.1.1 植物叶片衰老的机制及研究进展
• 1.1.2 小麦叶片衰老机制的研究进展
• 1.2 基因芯片的研究进展
• 1.2.2 基因芯片的应用
• 1.3 microRNA的研究进展
• 1.3.1 microRNA简介及作用原理
• 1.3.2 microRNA的检测方法
• 2 小麦叶片衰老基因芯片的制作、数据分析及验证
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦旗叶叶绿素含量的测定
• 2.2.2 总RNA的提取和纯化
• 2.2.3 cDNA的合成和纯化
• 2.2.4 cRNA的合成和纯化
• 2.2.5 芯片杂交
• 2.2.6 扫描芯片
• 2.2.7 数据分析
• 2.2.8 小麦旗叶基因芯片数据的定量PCR验证
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 小麦旗叶表达谱芯片
• 2.3.2 不同发育时期的小麦旗叶生理指标的测定
• 2.3.3 小麦旗叶表达谱芯片扫描结果
• 2.3.4 两张芯片对比分析的结果
• 2.3.5 差异表达基因的功能预测
• 2.3.6 不同发育时期的小麦旗叶分子生物学指标的测定
• 2.3.7 实时荧光定量PCR的检测结果
• 3 microRNA在小麦旗叶衰老中功能的初步探索
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 小麦旗叶总RNA的提取和纯化
• 3.2.2 反转录
• 3.2.3 实时定量PCR扩增
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 小麦旗叶四个时期总RNA
• 3.3.2 microRNA表达趋势颈环引物法定量检测结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢