儿茶素类化合物增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA作用及其机制研究

论文摘要

背景与目的：β-内酰胺类抗生素是临床上常用的抗菌药物，但是由于其不合理使用甚至滥用，临床上耐β-内酰胺类抗生素菌株日益增多。目前临床上金黄色葡萄球菌有90-95%是对青霉素耐药的，在亚洲70-80%的金葡菌为MRSA，而且其存在的多药耐药性，临床上治疗十分棘手。糖肽类抗生素是目前对抗MRSA的主要治疗药物，其中万古霉素被称为治疗MRSA感染的“最后一道防线”。但目前已出现耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（VRSA），因此寻找新的有效治疗方法迫在眉睫。有文献报道，天然药物中有多种物质具有增强现有抗菌药物抗菌作用的能力，这些物质被称为抗菌增敏剂。在前期实验中，我们发现山楂的粗提物中存在这样的组份。经过化学方法分离，得到了三种单体化合物。这三种单体化合物单独联合苯唑西林作用于MRSA没有或者只具有微弱的抗菌增敏作用，但是三者联合却具有更强的抗菌增敏效果。经过结构鉴定，其中一种单体化合物是儿茶素（C），而其余因为上样量不足，无法鉴定结构。我们购买了7种可以得到的儿茶素类化合物，通过体外活性筛选，发现联合后具有较好抗菌增敏作用的物质为儿茶素（C）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子酸儿茶素（EGC）。我们将这3种物质的配伍进行正交试验（C、ECG、EGC的配伍本文称之为C2E），通过体外活性观察确定具有最佳抗菌增敏作用的药物配伍比，并在体内外观察其抗菌增敏作用，并根据MRSA的主要耐药机制对其抗菌增敏作用机制进行研究。研究方法：1.根据前期工作基础，从可以获得的儿茶素类化合物中筛选出具有增加苯唑西林抗MRSA WHO-2活性作用的药物，并以C为中心筛选得到具有最佳抗菌增敏作用的儿茶素类化合物的配伍和配伍比。观察该配伍与苯唑西林、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、泰能等β-内酰胺类抗生素联合使用后的抗MRSA WHO-2活性的作用，并在25株MRSA临床分离株中对其联合β-内酰胺类抗生素的抗菌增敏作用进行观察。2.建立MRSA WHO-2菌株感染所致的脓毒症小鼠模型，根据处理方式给予苯唑西林和不同剂量的C2E，观察7天内各组小鼠的存活情况。观察给药2h、4h后各组模型小鼠血中的细菌数量，并观察不同时相点上细胞因子TNF-α和IL-6的水平。3.通过生物传感器技术观察3种化合物与PBP2a蛋白的亲和力，利用RT-PCR观察C2E对mecA基因表达的影响。将经过三种儿茶素类化合物处理过的MRSA WHO-2细菌离心收集并以PBS重悬后，与柔红霉素进行孵育，分别取适量的细菌通过荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜观察菌体内发出的荧光。利用RT-PCR技术观察MRSA中常见的药物外排泵基因经过C2E处理后的表达情况，并利用Real time PCR方法观察外排泵基因mepA在C2E处理后的表达情况。主要结果：1. C、ECG、EGC三种药物单独联合或者两两联合苯唑西林使用时没有或者只有微弱的抗菌增敏作用，但是三者联合使用时抗菌增敏作用明显，将三种药物按照正交试验配伍后进行观察，根据实验结果选用C：ECG：EGC的质量比为1:1:1的配伍进行后期实验。该配伍在一定浓度时联合氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟作用于MRSAWHO-2均能产生抗菌增敏作用，FIC值均为0.38。2.药物总浓度为16μg/mL的C2E联合苯唑西林、氨苄西林、头孢唑林、头孢吡肟、泰能后对25株MRSA临床分离株中可产生抗菌增敏作用的菌株数所占比例分别为80%、76%、88%、80%、92%。3.在建立的MRSA WHO-2脓毒症小鼠模型中，剂量为100mg/（kg·d）的C2E联合苯唑西林处理组观察7天后，小鼠存活率为66.7%，与单独苯唑西林组比具有显著差异（p <0.05）。200mg/（kg·d）和100mg/（kg·d）的C2E联合苯唑西林在给药2h后观察到的细菌数量明显低于单独苯唑西林组（p <0.05），一定剂量的C2E联合苯唑西林在给药后不同时相点测得小鼠血清中IL-6的水平明显低于单独苯唑西林组（p <0.05）。4.3种化合物与PBP2a蛋白不具有高亲和力，C2E不能下调mecA基因的表达。C2E处理组的菌体中在荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜下观察到比其他处理组更强的荧光强度。外排泵mepA基因在C2E与苯唑西林联合处理组的表达与单独苯唑西林组相比明显下调（p <0.05），在Real time PCR中观察到mepA基因在C2E单独处理组的表达与单独苯唑西林组相比明显下调（p <0.05）。结论：1.儿茶素类化合物与β-内酰胺类抗生素联合可以对MRSA WHO-2产生抗菌增敏作用，具有最佳抗菌增敏效果的组合及比例为C：ECG：EGC的质量比为1:1:1。2. C2E与β-内酰胺类抗生素联合可以对MRSA临床分离株产生抗菌增敏作用。3. C2E与苯唑西林联合可以显著提高MRSA WHO-2脓毒症模型小鼠的存活率，其机制可能与降低外周血中细菌数量及血清中IL-6的水平有关。4. C2E的抗菌增敏作用与直接结合PBP2a或者抑制mecA基因表达无关，而与增加药物的集聚有关。增加药物的集聚可能是因为C2E下调外排泵mepA基因的表达。

论文目录

• 英文缩写注释
• Abstract
• 摘要
• 前言
• 第一部分 具有抗菌增敏作用的儿茶素类化合物的筛选、确定及其最佳配伍比的确定
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第二部分 C2E对MRSA标准菌株及临床分离株的抗菌增敏作用
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第三部分 C2E联合苯唑西林对MRSA WHO-2脓毒症模型小鼠的保护作用
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 第四部分 C2E抗菌增敏作用机制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 小结
• 全文讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述 抗MRSA药物研究进展
• 参考文献
• 硕士研究生期间撰写论文