BKCa对人子宫内膜容受性的影响及其机制研究

论文摘要

时至今日,调控胚胎着床和发育的具体机制仍不明确。成功的着床取决于胚泡的侵入能力和子宫内膜的容受性两方面因素。子宫内膜是个非常独特的组织,它在卵巢性激素的作用下在整个月经周期经历着巨大的变化——经由增生期至分泌期建立起内膜容受状态,为胚胎植入做准备。在一个非常短暂的称为种植窗（wOI）时期,子宫内膜细胞在介导母胎间的信号传导方面发挥着及其重要的作用。它们合成和分泌许多分子,为胚胎着床做准备。离子通道参与了许多细胞功能的实现,如：合成和分泌内源性因子包括性激素、神经递质。尽管在子宫中已经有一些离子通道被研究,但这些研究绝大多数将重点都着眼于离子通道对子宫肌细胞张力的调控作用。是否有离子通道参与了调控子宫内膜细胞的容受性的建立、调节wOI的表达需要被阐明。大电导Ca2+激活K+通道（Large conductance Ca2+ -activated K+ channel）,也称为Slo、BKCa或Maxik通道,广泛地表达于兴奋和非兴奋细胞中,并参与了许多生理过程,如激素的分泌、神经递质的释放、细胞的兴奋、心率和血管反应性以及平滑肌张力的调控等。BKCa不仅能被细胞内Ca2+离子激活,而且还能被跨膜电位去极化激活。对BKCa的研究至今为止主要集中在平滑肌细胞上,然而在其它的生理过程中它们也具有非常重要的作用,如：1)动作电位复极化；2)调控神经元的兴奋性；3)调控神经递质的释放；4)调控肌细胞的收缩和舒张；5)调控分泌细胞分泌各种激素、因子；6)参与先天免疫的建立；7)影响细胞的增殖、凋亡及肿瘤形成；8)影响细胞的容积、形态等。BKCa通道存在于线虫（新杆状线虫）,昆虫（果蝇）和哺乳动物等多种物种中。人类的BKCa基因最先从脑组织中克隆出来。已经知道在人体中脑组织、平滑肌、骨骼肌、耳蜗毛细胞、肾上腺皮质、成牙质细胞、胰岛细胞、结肠及肾脏上皮细胞等组织有BKCa的分布,我们前期的研究发现子宫内膜细胞中也有其表达,然而对其是否参与了子宫内膜容受性的建立,我们仍一无所知。在本研究中我们进一步验证了BKCa在子宫内膜的表达及其分布规律,探讨了它对WOI因子转录表达的影响、对胚胎着床的影响,并对其机理进行了研究。第一部分BKCa在人子宫内膜组织中的表达、分布目的：确认BKCa在人子宫内膜细胞上的表达,及在月经周期不同时期的表达变化,分析BKCa在特定不孕人群中的表达差异。方法：对80例正常月经周期人子宫内膜组织（其中增生期44例,中分泌期36例）采用qRT-PCR法,Western blotting法半定量检测BKCa的表达水平。用免疫组化法检测BKCa在子宫内膜的定位。用全细胞膜片钳检测细胞膜K+电流的变化。结果：1.在36例中分泌期子宫内膜中BKCa mRNA和蛋白的表达明显高于44例增生期子宫内膜中BKCa mRNA和蛋白的表达（p<0.05）。2.管性不孕的妇女接受IVF-ET（?）台疗后治疗失败组（failed subgroups,21例）的中分泌期子宫内膜中BKCa mRNA和蛋白的表达明显低于治疗成功组（successful subgroups,15例）的妇女,（p<0.05）。3.免疫组化显示BKCa主要定位于子宫内膜细胞的腺上皮和腔上皮,间质细胞上有弱表达。4.全细胞膜片钳检测显示人子宫内膜细胞有电压依赖的电流,而这种电流可以被0.1μM IbTX特异性的阻断结论：BKCa表达于人子宫内膜上皮细胞中,其表达水平在月经周期不同时期及在接受IVF-ET后不同妊娠结局的患者的子宫内膜细胞中的差异表达可能和子宫内膜容受性的建立有关。第二部分BKca参与子宫内膜容受性的调控目的：应用体外粘附模型和在体动物种植模型来研究BKca是否参与对胚胎粘附和着床的调控,并利用研究BKca功能的工具药IbTX和siRNA干扰技术研究了BKCa对子宫内膜容受性标志性因子——WOI因子的调控。方法：1.以JAr和Ishikawa细胞构建体外粘附模型,通过siRNA干扰子宫内膜细胞中BKCa表达观察滋养细胞球粘附率的变化,评价BKCa在滋养细胞球粘附到子宫内膜细胞中的作用。2.建立在体动物胚胎种植模型,以靶向BKCaα亚单位的siRNA干扰受孕小鼠子宫内膜BKCa的基因的表达,观察BKCa对胚胎种植的影响。3.培养原代子宫内膜细胞,以IbTX为工具药阻断细胞中BKca的功能,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中种植窗（WOI）因子（LIF、integrinβ3.claudin-4和DKK-1）的变化。4.培养Ishikawa细胞,以IbTX为工具药阻断细胞中BKCa的功能,或以靶向BKCa的siRNA干扰细胞中BKCa的表达,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中种植窗（WOI）因子（LIF、integrinβ3、claudin-4和DKK-1）的变化。结果：1.体外粘附模型中,与对照组相比,siRNA干扰组的滋养细胞球粘附率显著降低。而如果用siRNA干扰同时加用LIF处理,则粘附率下降趋势被明显削弱,与对照组相比没有显著性差别。而单用LIF组粘附率没有明显改变。2.在体动物胚胎种植模型显示,靶向BKCaα亚单位的siRNA成功干扰基因表达后,胚胎着床数明显低于对照组。3.在原代子宫内膜细胞中,当阻断BKCa的功能时,LIF、integrinβ3、claudin-4和DKK-1的表达水平与对照组相比明显下降,（p<0.05）。4.在Ishikawa细胞中,当阻断BKCa的功能时,LIF、integrinβ3、claudin-4和DKK-1的表达水平与对照组相比明显下降,（p<0.05）;siRNA干扰组Ishikawa细胞中LIF、integrinβ3、claudin-4和DKK-1表达的变化趋势和IbTX组中一致。结论：子宫内膜细胞中BKCa通过调控WOI因子的表达影响子宫内膜的容受性,进而影响胚胎粘附、着床。第三部分BKCa调控子宫内膜细胞WOI因子的机制研究目的：初步探讨子宫内膜细胞中BKCa调控WOI因子表达的可能机制。方法：1.应用显微荧光测定法检测子宫内膜细胞中Ca2+的浓度,观察IbTX处理组和对照组间Ca2+离子浓度的变化,评价BKCa对细胞内Ca2+离子浓度的影响。2.应用EMSA法测定IbTX处理组与对照组子宫内膜细胞中NF-κB活性变化,评价BKCa对细胞中NF-κB活化的影响。3.应用Western blotting（?）去检测IbTX处理组与对照组子宫内膜细胞中IκB-α的降解情况,进一步确定BKCa对细胞中NF-κB活化的影响。结果：1.ATP刺激子宫内膜细胞会引起细胞内Ca2+浓度明显升高。而IbTX对内膜细胞因ATP刺激引起的胞内Ca2+浓度的升高有明显的抑制作用,（p<0.05）。2.EMSA检测显示IbTX会显著抑制子宫内膜细胞中性激素诱导的NF-κB的活化,（p<0.05）。3.Western blotting法检测显示在性激素诱导30分钟时,子宫内膜细胞中IκB-α的降解最为明显,而加用IbTX处理细胞会显著削弱性激素诱导的IκB-α的降解。在60分钟时,性激素加或不加IbTX处理组的细胞中IκB-α的降解已恢复到与对照组相同的水平。结论：BKca参与调控细胞中Ca2+浓度和NF-κB的活化。BKca可能正是通过这两个途径调节WOI因子的表达,影响子宫内膜细胞容受性,进而影响胚胎的着床。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 目次
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 BKCa在人子宫内膜组织中的表达、分布
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 BKCa参与子宫内膜容受性的调控
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• Ca调控子宫内膜细胞WOI因子的机制研究'>第三部分 BK_Ca调控子宫内膜细胞WOI因子的机制研究
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 综述
• 参考文献
• 作者简介及在读期间所取得的科研成果