神经生长抑制因子结构、性质和功能关系的研究以及淀粉样多肽神经毒性机理的研究

论文摘要

阿尔茨海默氏症（Alzheimer Disease,AD）是一种中枢神经系统原发性退行性疾病,它是威胁老年人群健康的主要病种之一。AD属于多病因综合症,其病因及发病机制迄今还是个不解之谜。早期科学家发现,大多数AD患者大脑呈现异常高的神经营养活性。1989年Uchida通过实验证明了这一现象是由AD患者脑中缺乏能够抑制神经元生长的抑制因子。1991年他成功的从正常人脑中分离到这一仅有68个氨基酸组成的蛋白。它在脑提取液存在的情况下能够抑制神经元的过度生长,因而被称为人类神经生长抑制因子（human neuronal growthinhibitory factor,hGIF）。hGIF与哺乳动物金属硫蛋白（metallothionein,MT）序列的同源性高达60%以上。同时在一级结构水平上,hGIF与MT家族其它分子还有许多共同之处,如氨基酸序列都含有20个相当保守的半胱氨酸,并存在MT特有的Cys-X-Cys,Cys-X-X-Cys,Cys-Cys序列和缺乏精氨酸（Arg）,组氨酸（His）,亮氨酸（Leu）,异亮氨酸（Ile）以及芳香氨基酸。所以,Palmiter等人又将hGIF命名为人类金属硫蛋白-3（human metallothionein-3,hMT3）。值得注意的是hGIF比MT1/2特意性的多了两个氨基酸插入片段,即第五位的苏氨酸（Thr）和第55—60位一段富含谷氨酸的六肽EAAEAE。本实验室已有多年研究金属硫蛋白的历史,曾经在大肠杆菌中构建了金属硫蛋白的高效表达体系,并且优化了纯化步骤,获得很高的蛋白产量;通过基因工程技术,本实验室还曾经构建了一系列hGIF的突变体,并且详细研究了Thr5和55EAAEAE60两个插入片段对hGIF结构、性质和功能的重要意义。在此基础上,为进一步阐明特定氨基酸残基或结构片段对hGIF结构、性质和功能的影响,我们全面而系统的考察了hGIF一系列位点上的突变对神经元生长抑制活性的影响。这些突变体包括:1)酸碱催化位点的对hGIF转硝基化及其生理功能影响的突变体（E23K突变体）;2)针对肽链N-端β-结构域保守的6TCPCP9序列（IG6和IG8突变体）;3)α-结构域对蛋白结构和功能的影响[β（MT3）-β（MT3）、β（MT3）-α（MT1）突变体];4)对linker的改造（K31/32A、K31/32E以及KKS-SP突变体）:5)hGIF双β-结构域突变体的构建[△33-35以及β（MT3）-β（MT3）突变体]。研究结果表明:1)E23K突变体完全丧失了神经生长抑制活性。研究表明,这个突变并没有影响蛋白的整体结构和金属硫簇的稳定性。但是DTNB反应的结果表明突变体的金属硫簇的溶剂暴露程度有显著的提高。同时,与hGIF相比,E23K突变体与SNOC的亚硝基化的速率发生了改变,整个反应呈现一个两相的过程:反应初始阶段反应速率有所增大,反应后期速率下降。因此我们认为,我们认为这个突变改变了NO的代谢途径,打乱了Zn2+在体内的分布,最终导致E23K突变体生理活性的丧失。2)β（MT3）-β（MT3）突变体的神经生长抑制活性与野生型hGIF相比明显降低了（54%vs.32%）,而β（MT3）-α（MT1）突变体的活性与野生型hGIF相当。这些结果充分说明了α-结构域对蛋白神经生长抑制活性具有重要意义。从与DTNB反应,EDTA反应以及pH滴定的结果来看,β（MT3）-β（MT3）突变体的β-结构域的金属硫簇的溶剂暴露程度明显增加而金属硫簇的稳定性明显下降;β（MT3）-α（MT1）突变体的β-结构域的金属硫簇的溶剂暴露程度和稳定性则基本维持不变。综上所述,我们认为尽管单α-结构域没有表现出活性,但是它却能通过结构域—结构域的相互作用来调控的β-结构域的构象和Zn2+释放,最终影响了其生理活性。3)K31/32和K31/32突变体的生理活性较野生型hGIF有所下降,而KKS-SP突变体的生理活性则完全丧失了。基本性质研究结果表明,linker中电荷的改变仅降低了金属硫簇的稳定性。而将KKS突变成SP后,不仅降低了突变体中金属硫簇的稳定性,也在一定程度上影响了蛋白的结构。所以,我们认为KKS对维持蛋白金属硫簇的稳定性、结构以及生理活性都有重要意义。从进化的角度看,这也可能是自然界为什么选择KKS作为金属硫蛋白的linker的一个原因。4)IG6突变体的生理活性有所下降,而IG8突变体的生理活性则几乎丧失。Gly的插入并没有对蛋白的结构以及金属硫簇的稳定性和溶剂暴露程度造成太大的改变。但是,对于IG8突变体来说,由于Gly插在了6CPCP9中间,破坏了hGIF与靶蛋白的相互作用,所以导致其生理活性几乎丧失。对于IG6突变体,Gly的插入并没有破坏6CPCP9的结构。但是,分子动力学模拟结果显示,IG6突变体第1—5位氨基酸残基的结构发生了比较大的改变。已有研究表明,富含脯氨酸的片段（proline-rich domain,PRD）两边的氨基酸残基的结构对于PRD与目标蛋白的相互作用也是非常重要的。所以我们认为,IG6突变体中第1—5位氨基酸残基结构的改变在一定程度上影响了其与靶蛋白的相互作用,进而导致该突变体生理活性的下降。5)通过对突变体△34-36基本性质进行研究,我们发现在α-结构域中缺失了两个Cys,的确变成了一个双β-结构域的蛋白,但是,与β（MT3）-β（MT3）突变体还是有较大的差异。这说明在MT中,金属硫簇的形成不仅和Cys的数目有关,还和Cys在肽链上的分布有关。生理活性测试结果表明,△33-35突变体的生理活性与野生型hGIF相当,而β（MT3）-β（MT3）突变体的生理活性则比野生型hGIF弱。从DTNB反应,EDTA反应以及pH滴定的结果来看,β（MT3）-β（MT3）突变体的β-结构域的金属硫簇的溶剂暴露程度明显增加,而且稳定性明显下降;而△33-35突变体的β-结构域的金属硫簇的溶剂暴露程度和稳定性基本没有改变。这些结果说明β-结构域金属硫簇的稳定性以及溶剂暴露程度对hGIF神经生长抑制活性具有重要意义。结合突变体蛋白的结构和反应性数据,我们认为hGIF的神经生长抑制活性是一系列因素综合作用的结果,包括（1）5TCPCP9序列,这个序列对hGIF的生理活性是至关重要的,没有这个结构片段,没有生理活性;（2）β-结构域中金属硫簇的溶剂暴露程度以及金属结合能力,这些性质可能影响hGIF与生物活性小分子（如NO）的相互作用;（3）结构域间的相互作用,这个相互作用可能改变β-结构域的构象以及金属硫簇的稳定性;（4）linker的影响等等。2002年,Chuang等人从羊脑中分离纯化得到羊神经生长抑制因子（sheepGIF,sGIF）。有趣的是,sGIF比其它哺乳动物GIF少了三个半胱氨酸,而且sGIF第五位是一个Ala,而不是哺乳动物GIF中常见的Thr。意外的是,生理活性测试结果表明,sGIF仍然具有活性（其抑制活性大概是hGIF的70%左右）。然而,当我们将hGIF的Thr5突变成Ala5后,突变体蛋白几乎完全失去了生理活性,暗示Thr5对维持蛋白的活性具有重要作用。为了找出这个GIF家族天然突变体的独特生理活性的原因,我们对sGIF的结构和性质进行了详细的研究。ESI-MS以及Cd2+滴定实验的结果表明,尽管sGIF蛋白只含有17个半胱氨酸,但是仍然可以结合7份Cd2+。这7个Cd2+离子被sGIF的肽链裹绕形成两个独立的金属硫簇:一个三金属硫簇和一个四金属硫簇,而且这个三金属硫簇的稳定性要比四金属硫簇的稳定性差。CD光谱以及113Cd NMR研究结果表明,sGIF的结构和动力学性质都较hGIF发生了很大的改变。同时,sGIF中金属硫簇的稳定性以及溶剂暴露程度也变化很大。所以,我们推测,由于3个半胱氨酸的缺失导致了sGIF形成了一种与sGIF完全不同的结构（包括肽链的折叠和金属硫簇的结构）。而这种新的结构部分补偿了Thr5侧链羟基在维持蛋白构象中所起的作用。淀粉样多肽Aβ（amylidβpeptide）是Alzheimer’s disease（AD）患者脑中老年斑的主要组成成分,在AD的发病机理的研究中占据着中心地位。到目前为止,有关于Aβ神经毒性的确切机理还不是很清楚。但是有研究结果表明,Aβ第35位的Met对它的神经毒性是很重要的。为了研究Met35影响Aβ神经毒性的机理,我们构建了几个突变体:分别将第35位的Met突变成Cys(Aβ1-35M35C)、Val(Aβ1-35M35V)以及Pro(Aβ1-35M35P)。神经元细胞培养结果表明,Aβ1-35M35V的神经毒性要比Aβ1-35强,而Aβ1-35M35P的神经毒性比Aβ1-35稍弱,而Aβ1-35M35C在10μM时都几乎不表现神经毒性。CD结果表明,Aβ1-35、Aβ1-35M35P以及Aβ1-35M35V经历了相似的变化过程,它们很快完成了由无规卷曲向β-折叠结构的结构转变。而Aβ1-35M35C保温1小时后,就由无规卷曲结构转变成α-螺旋结构,而且这个α-螺旋结构可以稳定地存在24小时,在整个过程中,我们没有观测到β-折叠结构的形成。ThT实验结果显示,Aβ1-35M35P聚集的动力学过程与Aβ1-35类似,荧光强度都在48小时左右达到最大。Aβ1-35M35V聚集的速率要比Aβ1-35快得多,其荧光强度在保温18小时左右就达到最大,说明Aβ1-35M35V比Aβ1-35以及Aβ1-35M35P更容易形成纤维化的聚集物。而Aβ1-35M35C即使在保温72小时后荧光强度也无明显的增加,说明Aβ1-35M35C不能形成β-折叠片层结构的聚集体。这些结果说明,Aβ的结构由无规卷曲到β-折叠的转变对其神经毒性的产生起到决定性的作用,而Met35则在这个结构转变中扮演这重要的角色。最近的研究表明,hGIF能够抑制淀粉样多肽Aβ的神经毒性,而MT1/2却不具有这样的活性。为了了解hGIF抑制Aβ神经毒性的机理。我们初步筛选了不同的hGIF突变体对Aβ神经毒性抑制作用。筛选结果表明,P7S/P9A突变体以及A55-60突变体都不具备抑制Aβ神经毒性的作用。而具体的原因还有待于进一步的研究。

论文目录

摘要

Abstract

第一章序论

第一节金属硫蛋白简介

一、金属硫蛋白的定义、分类以及结构

二、金属硫蛋白的生物学功能

第二节从金属硫蛋白到神经生长抑制因子

一、神经生长抑制因子的发现

二、神经生长抑制因子的表达和调控

三、神经生长抑制因子的结构

四、神经生长抑制因子的生理功能

第三节淀粉样多肽与阿尔茨海默症

一、淀粉样多肽Aβ的产生

二、淀粉样多肽Aβ的基因多态性

三、淀粉样多肽Aβ的结构

四、淀粉样多肽Aβ与金属离子

五、淀粉样多肽Aβ细胞毒性的分子机制

六、以淀粉样多肽为靶标治疗阿尔茨海默病的进展

第四节本论文研究的目的、内容和意义

参考文献

第二章人类神经生长抑制因子结构—性质—反应性—功能关系的研究

第一节酸碱催化位点对hGIF的影响

一、前言

二、突变体基因的构建

三、突变体蛋白的表达与纯化

四、E23K突变体蛋白基本性质的研究

五、E23K突变体蛋白的神经生长抑制活性研究

第二节 α-结构域功能的探讨

一、突变体基因的构建,蛋白表达、纯化与鉴定

二、突变体蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

第三节 Linker在hGIF分子中的作用

一、前言

二、突变体基因的构建,蛋白表达、纯化与鉴定

三、突变体蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

四、小结

5TCPCP⁹序列对hGIF结构、性质和生物功能的影响'>第四节⁵TCPCP⁹序列对hGIF结构、性质和生物功能的影响

一、前言

二、突变体基因的构建,蛋白表达、纯化与鉴定

三、突变体蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

第五节 hGIF双β-结构域突变体的构建及其结构、性质与功能关系的研究

一、前言

二、突变体基因的构建,蛋白表达、纯化与鉴定

三、突变体蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

参考文献

第三章羊神经生长抑制因子结构—性质—反应性—功能关系的研究

第一节 sGIF蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

一、sGIF基因的构建以及蛋白表达、纯化与鉴定

二、sGIF蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

第二节从人类神经生长抑制因子向羊神经生长抑制因子的结构转变

一、突变体基因的构建以及蛋白的表达、纯化与鉴定

二、突变体蛋白结构—性质—反应性—功能关系的研究

参考文献

第四章 Met35对Aβ淀粉样多肽神经毒性的影响及其毒性机理的研究

1-40基因序列的构建'>第一节 Aβ_1-40基因序列的构建

1-40的基因构建'>一、Aβ_1-40的基因构建

1-40在pGEX-4T-2/BL21体系中的表达'>二、Aβ_1-40在pGEX-4T-2/BL21体系中的表达

1-35的表达与纯化'>第二节 pET-31b体系中Aβ_1-35的表达与纯化

一、实验材料与方法

二、实验结果和讨论

三、结论

第三节 Met35对Aβ神经毒性的影响及其毒性机理的研究

一、实验材料和方法

二、实验结果与讨论

1-35神经毒性的抑制作用'>第四节 hGIF及其突变体对Aβ_1-35神经毒性的抑制作用

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果与讨论

参考文献

工作总结和展望

一、工作总结

二、展望

附录一本论文所涉及的基因测序结果

附录二本论文所涉及的蛋白质质谱结果

附录三本论文所涉及的缩略词

攻读博士学位期间已发表和完成的论文

致谢

神经生长抑制因子结构、性质和功能关系的研究以及淀粉样多肽神经毒性机理的研究

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