萝卜镉胁迫响应相关基因克隆及其表达分析

论文摘要

重金属污染严重危害到生态环境与人类健康。镉是一种植物非必需元素,是一种公认的重金属严重影响农产品的质量。过量的镉进入大气-水-生物圈,植物将其吸收并在根部、茎部、叶以及果实中积累,这不仅直接影响植物的生长发育,而且人类食用后会在人体中富集,严重危害人体健康。萝卜属于十字花科作物,是世界上重要的根菜类蔬菜。Cd响应的一些重金属螯合蛋白基因和一些酶以及转运相关的离子转运蛋白等吸收、累积、转运机制还未能得到全面了解,本研究以萝卜为供试材料,利用营养液培养法,克隆萝卜重金属相关基因,并进行镉胁迫下的基因表达特征分析；利用mRNA差异显示技术,进行镉胁迫下差异表达基因的分离鉴定,以期为解析植物重金属吸收累积的分子遗传机制提供理论依据。主要试验的研究结果如下：利用同源克隆法,分离到萝卜重金属螯合蛋白基因RsPCS和RsMT2。RsPCS全长2710 bp,由9个外显子和8个内含子组成,包含1458 bp的开放阅读框（ORF）编码相对分子质量为54.3 kDa的蛋白质,理论等电点为6.36。RsMT2基因包含一个252bp的ORF,其氨基酸序列含有高比例的Cys残基,约为19.3%,集中分布在肽链的N端和C端,呈CC,CXC,CXXC形式排列,属于典型的金属硫蛋白Ⅱ型家族。应用半定量和实时荧光定量PCR对RsPCS和RsMT2进行表达研究分析,结果表明RsPCS和RsMT2在萝卜叶片、花蕾、花瓣和根组织中均有表达；镉胁迫6h时提高了萝卜叶片中PCS基因在转录水平的表达以及植物络合素的含量；但镉胁迫下萝卜根中PCS基因的相对表达量降低,其表达受镉胁迫诱导。RsMT2随镉浓度的升高,表达量增加,其表达也受镉胁迫诱导。根据同源克隆法,对重金属离子运载蛋白IRT1、MTP1和CAX家族蛋白基因进行了克隆,分别得到基因组DNA和cDNA全长。生物信息学分析表明,RsIRT1具有8个疏水跨膜结构域,且含有信号肽,属于分泌蛋白,定位在细胞质膜上。半定量RT-PCR分析显示,正常供铁及正常供铁加镉时RsIRT1基因不表达,缺铁胁迫及缺铁加镉胁迫下大量表达。表明RsIRTl基因受外源缺铁胁迫所诱导,说明RsIRTl能够参与金属铁和镉的吸收和转运过程。与拟南芥AtMTP1同源性较高的基因命名为RsMTP1,其含有6个预测的跨膜区,并且在第4和5跨膜区之间有一个可变的富含组氨酸的序列。实时荧光定量PCR发现RsMTP1在花蕾中的相对表达量最高,其次是根和花瓣,叶片中的表达量最低；RsMTPl的表达具有组织特异性。Cd胁迫下RsMTP1在叶片中相对表达量受Cd诱导,随处理时间的延长总体表达量升高,96 h时是对照的3.15倍；但在根中相对表达量变化不明显。根据不同作物CAX基因保守序列设计特异引物,采用PCR及RT-PCR法进行扩增,获得’Nau-RG’材料CAX基因的两个家族成员的基因组DNA和cDNA序列,命名为RsCAX1和RsCAX2。序列分析发现,RsCAX1和RsCAX2均具有11个跨膜结构区,属于膜蛋白。利用实时荧光定量PCR对CAX基因的表达模式进行研究,转录水平分析表明RsCAX1在叶片中相对表达量最高,RsCAX2在花蕾中表达量最高,Cd胁迫后可诱导根中RsCAX1和叶片中RsCAX2表达。采用mRNA差异显示（DDRT-PCR）技术,成功克隆了萝卜在不用镉浓度处理96 h后差异表达的29条差异片段,其中25条与已知或推定功能基因高度同源的差异表达基因,如转录因子、表达调控子、胁迫响应和促进运输的基因,以及参与细胞代谢、脂类代谢、光合作用的基因,还有一些未知功能的基因也响应Cd胁迫。结果表明Cd胁迫下植物快速同时响应一系列基因表达,很多生理过程都受到影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1 重金属污染的危害
• 2 植物对重金属胁迫响应机制
• 2.1 植物对镉的螯合作用
• 2.1.1 植物络合素及结构
• 2.1.2 植物络合素合酶（phytochelatin synthase,PCS）
• 2.1.3 植物络合素在植物对重金属抗性中的作用
• 2.2 金属硫蛋白及在重金属结合中作用
• 3 植物Cd吸收转运分子机制
• 3.1 金属离子转运体ZIP蛋白（ZRT/IRT-like protein）家族
• 3.1.1 ZIP蛋白家族的结构特征
• 3.1.2 ZIP蛋白基因的表达特性
• 3.2 金属离子转运体CDF蛋白家族
• 3.2.1 CDF蛋自家族的结构特征
• 3.2.2 CDF蛋白基因的表达特性
• 3.3 金属离子转运体CAX蛋白家族
• 3.3.1 CAX蛋白家族的结构特征
• 3.3.2 CAX蛋白基因的表达特性
• 4 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第一章 萝卜RsPCS基因克隆与表达分析
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料和胁迫处理
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 所需试剂
• 1.4 萝卜基因组DNA与总RNA的提取
• 1.5 反转录cDNA第一条链的合成
• 1.6 引物设计与合成
• 1.7 萝卜PCS基因基因组DNA及cDNA特异扩增
• 1.8 PCS基因的克隆
• 1.8.1 目的片段的回收
• 1.8.2 大肠杆菌感受态的制备
• 1.8.3 重组质粒的构建
• 1.8.4 重组质粒的转化
• 1.9 序列测定及分析
• 1.10 萝卜镉处理植株GSH和NPT含量的测定
• 1.11 RsPCS基因表达研究
• 1.12 RsPCS基因实时荧光定量表达研究
• 2 结果与分析
• 2.1 萝卜PCS基因的DNA与cDNA扩增
• 2.2 萝卜PCS基因的DNA与cDNA克隆及序列分析
• 2.3 RsPCS氨基酸序列同源性及系统树分析
• 2.4 萝卜镉处理植株PCs含量的变化
• 2.5 萝卜RsPCS基因的表达分析
• 3 讨论
• 3.1 RsPCS序列特征
• 3.2 Cd胁迫对萝卜中PCs和GSH含量的影响
• 3.3 Cd胁迫下PCS基因的表达特性
• 3.4 Cd胁迫下PSC基因的相对表达量与PCs含量的关系
• 第二章 萝卜金属硫蛋白Ⅱ基因克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和胁迫处理
• 1.2 萝卜MT2基因EST序列搜索
• 1.3 萝卜叶片基因组DNA的提取
• 1.4 萝卜叶片总RNA的提取及反转录
• 1.5 引物设计
• 1.6 MT2基因DNA全长克隆、测序
• 1.7 MT2基因生物信息学分析
• 1.8 RsMT2的表达分析研究
• 2 结果与分析
• 2.1 萝卜EST拼接
• 2.2 萝卜叶片总RNA的提取
• 2.3 萝卜MT2基因的扩增电泳结果
• 2.4 萝卜MT2基因的核苷酸序列分析
• 2.5 蛋白一级结构特征及理化性质分析
• 2.6 蛋白质家族预测及蛋白质亚细胞定位
• 2.7 萝卜金属硫蛋白的二级结构预测
• 2.8 萝卜MT2基因表达分析
• 3 讨论
• 3.1 MT基因的诱导表达特性
• 3.2 MT基因的组织表达特性
• 第三章 萝卜IRT1基因克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料和胁迫处理
• 1.2 总DNA和RNA提取及cDNA合成
• 1.3 引物设计与合成
• 1.4 萝卜IRT1基因全长克隆及测序
• 1.5 IRT1基因的表达分析
• 2 结果与分析
• 2.1 萝卜EST拼接
• 2.2 萝卜RsIRT1基因DNA克隆及分析
• 2.3 萝卜与其他植物铁转运蛋白序列的多重比对
• 2.4 萝卜与其他植物铁转运蛋白氨基酸序列的系统发生分析
• 2.5 推测的萝卜铁转运蛋白RsIRT1的蛋白特征
• 2.5.1 萝卜铁转运蛋白RsIRT1的跨膜结构分析
• 2.5.2 萝卜铁转运蛋白IRT1的二级结构预测
• 2.5.3 萝卜铁转运蛋白IRT1的信号肽预测
• 2.6 萝卜铁转运蛋白IRT1的亚细胞定位
• 2.7 萝卜RsIRT1基因的表达特性分析
• 3 讨论
• 2+/H⁺反向转运体基因CAXl和CAX2克隆与表达特性分析'>第四章 萝卜Ca²⁺/H⁺反向转运体基因CAXl和CAX2克隆与表达特性分析
• 1 材料方法
• 1.1 试验材料和胁迫处理
• 1.2 研究方法
• 1.2.1 萝卜叶片基因组DNA的提取
• 1.2.2 萝卜叶片总RNA的提取及反转录
• 1.2.3 引物设计
• 2
• 2.2 萝卜与拟南芥和水稻CAX家族成员的蛋白序列同源性分析
• 2.3 萝卜CAX亲水性分析及跨膜区预测
• 2.4 萝卜CAX基因表达分析
• 3 讨论
• 第五章 萝卜金属离子转运体基因RsMTP1克隆与表达特性分析
• 1 材料方法
• 1.1 试验材料和胁迫处理
• 1.2 研究方法
• 1.2.1 萝卜叶片基因组DNA的提取
• 1.2.2 萝卜叶片总RNA提取与反转录
• 1.2.3 引物设计
• 1.3 萝卜MTP1基因全长克隆及测序
• 1.4 MTP1基因的表达分析
• 2 结果与分析
• 2.1 萝卜MTP1的克隆及序列分析
• 2.2 萝卜RsMTP1与其他植物CDF家族基因的氨基酸序列比对
• 2.3 萝卜MTP1蛋白序列的结构分析
• 2.4 RsMTP1的表达模式
• 3 讨论
• 3.1 CDF家族的结构特征
• 3.2 Cd胁迫对MTP1基因表达影响
• 第六章 利用DDRT技术分离萝卜镉胁迫相关基因
• 1 材料和方法
• 1.1 植物材料和胁迫处理
• 1.2 总RNA的提取
• 1.3 cDNA第一条链的合成和DDRT-PCR
• 1.4 PCR产物的聚丙烯酰胺电泳展示
• 1.5 差异cDNA的二次扩增与克隆、测序
• 1.6 差异片段的RT-PCR表达分析
• 2 结果与分析
• 2.1 萝卜总RNA的提取
• 2.2 萝卜镉响应mRNA差异显示分析
• 2.3 差异表达基因片段的再扩增
• 2.4 萝卜Cd响应基因片段的DDRT分析
• 2.5 响应镉胁迫的差异表达基因片段的功能分类
• 2.6 差异片段的RT-PCR表达分析
• 3 讨论
• 3.1 mRNA差异显示技术的优缺点
• 3.2 差异表达片段在Cd胁迫下的功能
• 全文结论
• 参考文献
• 发表论文情况
• 致谢