论文摘要
前言蛋白激酶B（PKB/AKT）是一种多功能丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在细胞的生长过程,如新陈代谢、细胞增殖、凋亡、转录以及细胞迁移中均起着重要的作用。在哺乳动物中,AKT1、AKT2和AKT3（又分别叫PKBα、PKBβ和PKBγ）有相似的结构域并且能够被大量的生长因子以PI3K依赖的方式被激活。AKT的N末端1～106位是它的PH结构域,这个区域在信号转导中被认为可以介导PKB/AKT与其它蛋白质的相互作用,PH域可以结合磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸盐（PtdIns（3,4,5）P3）等磷脂,PH域与磷脂酰肌醇的结合使AKT定位于细胞膜,AKT在膜的聚集是其活化的标志,其Thr308位点的磷酸化可能促进C-末端疏水基序的构象发生改变,而其Ser473位点的磷酸化则是浆膜定位的一个必要条件。AKT在S期的起始和G2/M转换过程中起了重要的作用,AKT1可以磷酸化p21的T145及p27的T157和T198,导致它们在细胞质中的易位与功能的尚失,而p21与AKT2结合后即不再被AKT1磷酸化。AKT也通过促进CDC25B的磷酸化调节G2/M的转化,但是一直没有报道是哪一种亚型在G2/M转化过程中发挥作用。脯氨酸丰富的肌醇多磷酸5磷酸酶（PIPP）,又名磷脂酰肌醇4,5-二磷酸盐5磷酸酶A（PIB5PA）,能去磷酸化PtdIns（3,4,5）P3右旋第5位磷酸盐和PtdIns（4,5）P2的肌醇环,分别形成磷脂酰肌醇3,4-二磷酸盐和磷脂酰肌醇4磷酸盐。PIPP在多种组织中表达,如脑、心、肾、胃、小肠和肺,但是它在这些组织中的特异性作用仍然需要探索。特别是,PIPP在1-细胞期胚胎中的作用,至今国内外没有任何报道。本研究以检测AKT的表达与活性为基础,探索PIPP和催化失活型的PIPP-H557A通过AKT及其下游底物对小鼠1-细胞期胚胎有丝分裂的作用,以期为研究PIPP在受精卵早期发育中的作用奠定基础。实验材料与方法一、动物来源中国医科大学实验动物部提供昆明系小白鼠。二、试剂pEFBOS-PIPP、pEFBOS vector和pEFBOS-PIPP-H557A由Mitchell教授惠赠;限制性内切酶MluI购自Fermentas公司;抗体购自Santa Cruz;其它试剂如果没有特指,均购于Sigma公司。三、小鼠卵母细胞以及受精卵的采集和培养取2～3周龄的昆明系雌性小鼠,腹腔注射5IU孕马血清PMSG,48h后颈椎脱臼法处死,取出卵巢,置于含有M2的培养液中,在显微镜下刺破大的有腔卵泡,释放含完整生发泡（GV）的天然裸卵母细胞,收集并贮存。根据Hogan的方法进行小鼠受精卵的超排和收集,取4～6周龄成熟雌性,腹腔注射PMSG 10 IU/只,48h后腹腔注射hCG 10 IU/只,当日与8周龄以上成熟雄性昆明系小鼠合笼过夜,次日清晨检查雌鼠阴栓,有阴栓者为交配成功,脱颈椎处死雌鼠,取双侧输卵管,剪下末端膨大置于M2培养液中,实体显微镜下撕开壶腹处,使受精卵细胞团自然流出,用M2培养液洗受精卵,把需要培养的受精卵移入M16培养液中,按不同的时间点收集G1,S,G2与M期的受精卵。四、RT-PCR将收集到的各期受精卵（200个卵/组）,用QuickPrep Micro mRNA Purification试剂盒按操作步骤提取RNA。用TaKaRa RNA PCR（AMV）试剂盒进行反转录和PCR。使用AMV（avian myeblastosia virus）反转录酶将mRNA合成cDNA的第一链,反转录实验按操作步骤说明。用Primer5软件设计引物在NCBI网站上BLAST确认之后,由上海生工生物技术有限公司合成。五、转染将受精卵接种于含100μl M16培养液的96孔板中,转染时受精卵处于G1期（hCG注射后19～20h）。用脂质体LipofectamineTM2000转染质粒,按试剂盒按说明书,无菌条件下,首先,在含24.5μl的M16培养液的Eppendorf管中加入0.5μl的LipofectamineTM2000脂质体,同时在另一个含23.5μl的M16培养液中加入1.5μl（0.2μg）pEFBOS-PIPP、pEFBOS vector或pEFBOS-PIPP-H557A质粒,室温静置5min。然后,将两种液体混匀,室温静置20min。最后向含受精卵的培养液中加入脂质体与质粒DNA的复合物共50μl,置于37℃,5%CO2培养箱中培养并按需要收集。六、间接免疫荧光法将待用的对照组及处理组受精卵移入新鲜配制的4%多聚甲醛液中,固定30min（37℃）,用含0.1%Triton-X100的PBS处理15min（37℃）,以增加细胞膜通透性,清洗液充分清洗后把卵移入封闭液滴中,37℃,1h。用兔多克隆抗pAKTSer473抗体室温孵育1h或4℃过夜。然后移入FITC标记的二抗,室温避光孵育30min后,用清洗液去除未结合的二抗,再用PI（用于激光共聚焦）或Hochest33258（用于荧光显微镜）染核。激光共聚焦或荧光显微镜下观察pAKTSer473蛋白定位的改变。七、AKT的抑制剂对小鼠受精卵卵裂率的影响将pEFBOS-PIPP和/或pEFBOS vector质粒转染的受精卵置于,M16培养液中,在37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内培养,转染后10h,用相差显微镜观察并记录受精卵卵裂的情况,然后进行统计学分析,对照组比较,如果P＜0.05即具有统计学意义。八、Western Blot样品加入20μl蛋白提取缓冲液,反复冻融3次,加入SDS样品缓冲液2.0ul,100℃煮沸5min,12%SDS-PAGE电泳分离蛋白质,然后将蛋白转至硝酸纤维素膜上,再将滤膜与抗pAKT1/2/3 Ser473的抗体、抗CDC2 Tyr15抗体或抗β-actin抗体4℃温育过夜,经PBST洗涤后,用羊抗兔的IgG作为二抗室温孵育2h,经PBST洗涤膜后,化学发光法显影成像。九、AKT与MPF的活性测定将收集的鼠卵冻融3次,使细胞裂解,加入AKT或MPF反应液25μl,30℃水浴反应30min,取25μl点在Whatman P81强阳离子交换滤纸上,以75 mmol/L磷酸溶液终止反应,洗膜2次,每次2min。将滤纸置于含10ml蒸馏水的液闪瓶内,用Beckman液闪计数仪测定cpm值。十、数据处理实验结果应用SPSS 11.5统计学软件进行one-way ANOVA检验,所有的值用mean±SD表示,每组实验重复3次,P＜0.05被认为具有统计学意义。实验结果一、AKT在小鼠受精卵中的表达与活化RT-PCR的检测结果显示,AKT1的mRNA表达在小鼠GV期卵母细胞以及小鼠受精卵中的G1,S,G2和M期,而AKT2则仅表达在1-细胞胚胎中的G1期。对p-AKT1/2/3 Ser473蛋白检测显示,Ser473位磷酸化的AKT在受精卵中表达的量远远大于它在GV期卵母细胞中的表达。免疫荧光分析的结果显示,结合Ser473位磷酸化AKT的绿色荧光FITC在GV期卵母细胞中均匀分布在胞浆中,而在S期的受精卵中绿色荧光分布于细胞膜,AKT的膜定位表明在S期的受精卵中它可能处于活化状态。当在G1期的受精卵中加入AKT的抑制剂Wortmannin时,其定位从周边转向分布于整个细胞内,并以胞核为主,表明其活性受到抑制。结果建议,Ser473位磷酸化AKT的定位与其活性密切相关,可能是其活性的表现形式。对AKT活性的检测证明在小鼠受精卵中AKT的活性远远高于它在GV期卵母细胞中的活性,说明在小鼠受精卵中AKT可能处于充分的活化状态。二、PIPP在小鼠受精卵中对AKT及其信号途径的作用蛋白分析显示,PIPP明显降低了AKT Ser473位点磷酸化。建议,PIPP可能通过调节AKT的表达参与对AKT下游效应子的调节,并因此调控与AKT有关的小鼠受精卵的有丝分裂。结果显示,在PIPP转染的小鼠受精卵中,AKT的定位从细胞膜转向细胞核,受精卵卵裂率降低,MPF活性下降,CDC2 Tyr15的去磷酸化发生阻滞。三、PIPP-H557A在小鼠受精卵中对AKT及其信号途径的作用催化失活型PIPP-H557A对受精卵的作用与PIPP正好相反,说明,PIPP557位点的组氨酸对PIPP的催化活性具有决定意义,它的突变使PIPP失去了其5磷酸酶的催化活性。讨论作为一个维持有机体正常生命活动的重要调节子,AKT受许多生长因子的调控,如血小板源性生长因子PDGF、表皮生长因子（EGF）、胰岛素和神经生长因子（NGF）等。AKT的活化主要是通过PI3K/AKT调节,失活的、细胞质内的AKT转位到浆膜通过PH域去结合由PI3K活化产生的PtdIns（3,4,5）P3和/或PtdIns（3,4）P2,以此改变AKT的构象使其变得易于被上游激酶磷酸化,AKT的膜定位是其活化的标志。我们对小鼠受精卵中Ser473位磷酸化AKT定位的观察显示,AKT集中在S期小鼠受精卵的细胞膜,当使用PI3K/AKT途径的特殊抑制剂,Wortmannin等处理受精卵时,AKT的分布转位到小鼠受精卵的细胞核以及细胞质中,究其原因可能是由于PIPP使PtdIns（3,4,5）P3生成下降并且转位到核区的结果。这些结果符合以前的对体细胞中AKT研究的报道,也应该为进一步研究小鼠受精卵发育过程中AKT的作用提供了重要的科学依据。我们检测到了AKT1在小鼠受精卵中的4个时期和不成熟卵母中的表达,说明AKT1在受精卵的发育过程中是必要的信号蛋白,但是令人惊异的是AKT2的mRNA仅仅表达在受精卵的G1期。资料显示,AKT1是细胞增值所必需的蛋白,AKT1磷酸化p27可以损伤了p27的核输入序列,而AKT2则通过与p21结合促进细胞周期转变。结合实验结果,我们认为AKT2在G1期的表达应该起到了一个负调控的作用,而AKT1与AKT2在表达时间上的不同说明它们在1-细胞胚胎分化的过程中起了不同的作用,并且应当具有不同的信号转导途径,当然,关于它们的具体作用需要进一步的研究。对Ser473位点磷酸化的AKT在蛋白表达水平的检测,我们发现在受精卵中Ser473位磷酸化AKT的表达量明显高于它在GV期卵母细胞中的表达,以G2期为最高。此结果也与相应的AKT的活性分析一致,在受精卵中的活性明显高于其在GV期卵母细胞中的活性。在哺乳动物的有丝分裂中,M期促进因子MPF（M-Phase Promoting Factor）的活化在有丝分裂的G2/M转换过程中起着关键的作用,它的活化主要由CDC2激活,CDC2 Thr14和Tyr15的磷酸化抑制CDC2活性,而它们的去磷酸化却激活了CDC2,同时CDC2的活化加速了M期的启动,在G2/M转换期间,MPF的活性达到高峰。为探索AKT影响细胞周期的分子途径,我们研究了小鼠1-细胞胚胎中MFP的活性在AKT抑制剂作用下的改变。也检测了AKT的上游,肌醇多磷酸5-磷酸酶PIPP对AKT活性的调解,我们的结果与以前在体细胞中检测的报道一致,而且我们对PIPP mRNA在受精卵中表达的检测是首次报道,在对催化失活型PIPP-H557A的检测中,我们发现PIPP第557位的组氨酸突变为丙氨酸后其活性尚失并且失去了调节AKT活性的能力。根据实验结果,我们推论PIPP在小鼠受精卵中降低AKT Ser473位点的磷酸化,并且有可能通过此途径干涉细胞周期的进程,抑制其下游的MPF活性以及CDC2 Tyr15去磷酸化状态。总之,我们的实验揭示AKT Ser473位点的磷酸化在小鼠受精卵及初级卵母细胞中的定位、表达及其活性的变化。并且发现在小鼠受精卵中,PIPP能通过降低AKT Ser473位点的磷酸化调节1-细胞阶段胚胎的有丝分裂进程。我们的结果为哺乳动物受精卵的早期发育、细胞周期以及肿瘤的发生等研究提供了重要依据。结论1、在小鼠受精卵的中,AKT1与AKT2 mRNA的表达不同,AKT1在受精卵的发育过程中是必需的。2、在小鼠受精卵的S期中,AKT1定位于细胞膜。3、AKT1可能调控小鼠受精卵中G2/M期的转换。4、在小鼠受精卵中,PIPP通过降低AKT的活性,调节G2/M期的转换,而催化失活型的PIPP-H557A不能降低AKT的活性。