论文摘要
细胞因子信号负调控因子（suppressors of cytokine signaling, SOCSs）是具有负性调控细胞因子信号通路功能的蛋白家族,其最初是作为JAK （Janus kinas） /信号转导及转录活化子（signal transduction and activators of transcription, STATs）信号通路的负性调控因子被发现的。近年来越来越多的研究证实除JAK/STAT信号通路外,SOCS还参与负性调控其他的重要细胞内信号分子如Ras/Erk、PI3K/Akt等的活性。研究证实基因甲基化导致的SOCS3表达下调和缺失与肿瘤的发生密切相关,推测SOCS3基因可能作为抑癌基因发挥作用。目前国内外关于SOCS3参与肿瘤发生机制的研究中,大多局限在SOCS3对STAT3的调控,而SOCS3是否参与调控在肿瘤发生过程中发挥重要作用的其他信号分子如Ras/Erk1/2、PI3K/Akt,此类研究甚少。本研究将外源性SOCS3基因导入A549和SPC-A1肺腺癌细胞株,观察其对肺腺癌细胞生长、粘附、迁移和侵袭能力的影响,探讨SOCS3对肺腺癌细胞内信号分子活性的调控机制,为SOCS3最终能否作为肿瘤基因治疗的靶点提供理论依据。研究内容:1、选取肺腺癌细胞株（A549和SPC-A1）,应用lipofectamine 2000将SOCS3表达载体和筛选载体共转染细胞,G418筛选,建立SOCS3稳定表达肺腺癌细胞株。RT-PCR和免疫荧光检测细胞中SOCS3 mRNA和蛋白表达。2、集落形成实验、MTT法、裸鼠移植瘤模型观察外源性SOCS3基因对肺腺癌细胞生长的影响。3、MTT法检测SOCS3基因对肺腺癌细胞化疗药物敏感性的影响。4、细胞粘附实验、划痕实验和Boyden Chamber法观察SOCS3基因对肺腺癌细胞粘附、迁移和侵袭能力的影响。5、Western blot法检测SOCS3对STAT3、Erk1/2、Akt信号分子活性的影响及细胞周期蛋白（cyclinD1、p21）的表达变化;半定量RT-PCR和明胶酶谱分析检测SOCS3对基质金属蛋白酶（MMP2、9）表达和活性的影响。结果:1、肺腺癌细胞株A549、SPC-A1在常规培养条件几乎检测不到SOCS3基因表达。2、转染细胞经G418筛选后获得SOCS3稳定表达肺腺癌细胞株;RT-PCR和免疫荧光检测证实SOCS3基因转染组细胞中SOCS3 mRNA和蛋白水平均有表达。3、SOCS3稳定表达A549和SPC-A1细胞克隆形成抑制率分别为73.8%和55.9%。SOCS3稳定表达A549细胞的倍增时间（64.5±1.6h）较对照组（49.2±0.9h）明显延长（P<0.01）。SPC-A1细胞也取得了相似的结果（56.9±1.5h vs. 44.8±1.0 h, P<0.01）。4、化疗药物敏感性检测发现,SOCS3可将A549细胞对顺铂、阿霉素、紫杉醇的敏感性分别提高3.1、3.9、7.3倍;而SOCS3可将SPC-A1细胞对顺铂、阿霉素、紫杉醇的敏感性分别提高3.4、3.4、6.4倍。5、与对照组相比,SOCS3稳定表达A549和SPC-A1细胞移植瘤生长缓慢,瘤重显著降低（0.33±0.08g vs.1.06±0.13g in A549; 1.28±0.31g vs. 2.96±0.69g in SPC-A1; P<0.01）;A549和SPC-A1移植瘤模型的抑瘤率分别为68.9%和56.8%。6、细胞粘附实验结果显示,SOCS3稳定表达A549细胞在Matrigel及FN上粘附率（41.2±2.2%和38.8±4.6%）,较对照组（73.5±8.1%和66.8±6.5%）显著降低（P<0.01）;SOCS3稳定表达SPC-A1细胞在Matrigel及FN上粘附率分别为（37.2±3.5%和39.6±4.2%）,较对照组（63.9±4.6%和56.4±5.3%）显著降低（P<0.01）。细胞迁移实验结果显示SOCS3稳定表达细胞在培养18h穿膜细胞数为19.3±2.1（A549）和23.4±5.2（SPC-A1）,较对照组41.7±3.5 （A549）和47.7±6.5 （SPC-A1）显著减少（P<0.01）。细胞侵袭实验结果显示48h后SOCS3稳定转染细胞穿膜细胞数分别为12.3±2.5（A549）和14.7±4.4（SPC-A1）,均较对照组23.0±4.0 （A549） （P<0.05）和34.5±5.4（SPC-A1） （P<0.01）显著减少。7、在常规培养条件下,与对照组细胞相比,SOCS3稳定表达A549和SPC-A1细胞中pSTAT3几乎检测不到（P<0.01）;pErk1/2, pAkt水平也明显下降（P<0.05）。EGF刺激后,SOCS3稳定表达A549中pSTAT3,pErk1/2,pAkt水平显著低于对照组（P<0.01;P<0.05）;SOCS3稳定表达SPC-A1中pSTAT3,pErk1/2显著低于对照组（P<0.01;P<0.05）;而pAkt水平与对照组无显著差异（P>0.05）。8、SOCS3稳定表达A549和SPC-A1细胞cyclin D1表达下调（P<0.01）、p21表达明显上调（P<0.01;P<0.05）;半定量RT-PCR和明胶酶谱分析结果显示SOCS3稳定表达A549和SPC-A1细胞MMP2、MMP9 mRNA表达和活性显著降低（P<0.05）。结论:1、肺腺癌细胞株A549、SPC-A1中几乎检测不到SOCS3基因表达。利用SOCS3真核表达载体,成功将外源性SOCS3基因转染细胞并获得稳定表达。2、外源性SOCS3显著抑制肺腺癌细胞株A549、SPC-A1的增殖、粘附、迁移和侵袭能力。3、外源性SOCS3显著增加肺腺癌细胞株A549、SPC-A1对化疗药物（顺铂、阿霉素、紫杉醇）的敏感性。4、外源性SOCS3通过负性调节STAT3、Akt和Erk1/2的活性,显著下调cyclin D1表达、上调p21表达,抑制MMP2、MMP9表达和活性。
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