论文摘要
急性心肌梗死是严重危害中老年人身体健康的常见病、多发病。目前临床上缺乏使梗死心肌再生的根本性治疗方法。早期溶栓、介入治疗虽然可以挽救濒死心肌,但只能防止梗死范围的扩大,对坏死心肌无效。尽管研究证实心肌干细胞的确存在,但并不足以满足组织再生的需求。坏死心肌最终形成瘢痕组织,可致心衰。大量研究表明干细胞移植治疗心肌梗死可改善梗死后心功能,显示出美好的前景。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）由于其具有来源广泛,具有自体、异体易获得性、体外可扩增性及多向分化潜能、遗传稳定、低免疫原性等优点,成为干细胞治疗心肌梗死研究的热点。有充分的证据表明:在缺血心肌或其他心脏疾病中,与缝隙连接形成相关的Connexin43表达显著减少及表达位置异常,这种变化成为心律失常及心肌功能障碍的基础。而研究也发现骨髓间充质干细胞移植至体内后无法与宿主心肌细胞有效整合。由此,我们设想将缝隙连接形成相关蛋白connexin43转染骨髓间充质干细胞,可能可以改善细胞间整合,从而进一步改善心肌修复。研究目的1.优化大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、扩增的方法。2.观察HIV-I型慢病毒载体作为基因转移载体的效果。3.观察大鼠骨髓间充质干细胞同种异体移植对大鼠心肌梗死的治疗作用。4.探讨connexin43基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞是否可进一步改善心肌梗死大鼠心功能恢复,是否可改善细胞间整合。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定方法以贴壁筛选法获取大鼠骨髓间充质干细胞,用低糖DMEM+10%胎牛血清作为基础培养基,通过及时传代对大鼠骨髓间充质干细胞进行纯化和扩增,显微镜观察细胞的结构,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记。结果体外扩增5代细胞大约为1x108个,细胞形态呈比较均一的长梭形、成纤维状。流式细胞仪检测扩增后BMSCs表面抗原特征,结果表明BMSCs强表达干细胞标记CD90、CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD14及CD45,证实为非造血干细胞的另一类干细胞。结论通过贴壁筛选法成功获取较高纯度及数量大鼠骨髓间充质干细胞,可满足进一步体内外实验需求。第二部分慢病毒载体介导人connexin43基因在骨髓间充质干细胞中的表达方法利用In-fusion技术将connexin43基因定向克隆至带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的HIV-I型慢病毒载体,构建connexin43重组质粒。重组质粒转化后挑取阳性克隆行酶切及测序鉴定。在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293T细胞,获取病毒上清并浓缩,测定病毒滴度后以合适MOI感染大鼠骨髓间充质干细胞。荧光显微镜下观察connexin43蛋白表达情况及感染率,并以半定量RT-PCR检测感染后大鼠骨髓间充质干细胞connexin43mRNA的相对表达量。结果琼脂糖电泳及测序证实成功构建重组connexin43质粒。获取较高滴度病毒（108）,病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞（MOI值50）感染率高。Connexin43转染细胞于荧光显微镜下可见胞膜点线状分布荧光。转染细胞Connexin43mRNA的相对表达量明显高于未转染细胞（p<0.01）。结论成功利用慢病毒载体将connexin43基因转移至大鼠骨髓间充质干细胞,Connexin43蛋白于转染细胞胞膜呈点线状分布。为进一步体内研究提供了较理想的基因修饰细胞。第三部分Connexin43基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死方法采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,30只大鼠随机分为三组,A组:connexin43-EGFP转染BMSCs移植组,n=10;B组:EGFP转染BMSCs移植组,n=10;C组:生理盐水组,n=10。结扎LAD半小时至一小时后心肌内移植相应的细胞或生理盐水,移植后4周检测心功能并取心肌检测各种相关指标。以28天为实验终点。检测心功能并取心脏检测各种相关指标。结果与对照组比较,心脏超声心功能检测显示A、B组均高于C组（P<0.05）,A组高于B组（P<0.05）。干细胞移植组较之生理盐水组心肌梗死面积均有缩小,以connexin43-EGFP转染BMSCs移植组更为明显。RT-PCR及western-blot提示心肌梗死大鼠心肌connexin43表达明显降低,EGFP转染BMSCs移植组connexin43表达量与生理盐水组无明显差异,而connexin43-EGFP转染BMSCs移植组connexin43表达量明显增高（P<0.01）。激光共聚焦显微镜提示同种异体大鼠BMSCs在心肌缺血、梗死区分布广泛,其细胞核呈椭圆形,类似心肌细胞核,并与宿主心肌纤维排列方向一致。并可见带connexin43基因表达的细胞与宿主心肌细胞位置接近,可能有缝隙连接形成。结论同种异体BMSCs移植治疗心肌梗塞可行、有效,可改善心功能,缩小梗死面积。BMSCs移植至梗死心肌后其connexin43表达明显下降,connexin43基因转染BMSCs可有效改善这种情况。connexin43基因转染BMSCs较未转染的BMSCs能更有效的改善心肌梗死大鼠的心功能,这可能与connexin43基因转染BMSCs高表达connexin43,从而可能有助于移植细胞与宿主细胞或宿主细胞间的整合有关。总结1.成功获取高滴度携带connexin43基因的重组慢病毒,首次利用慢病毒载体在大鼠骨髓间充质干细胞高效表达connexin43。2.首次证实BMSCs移植至梗死心肌后其connexin43表达明显下降,而connexin43基因转染BMSCs可有效改善这一状况。3.首次研究证实connexin43基因转染BMSCs较未转染的BMSCs能更有效的改善心肌梗死大鼠的心功能,这可能是由于connexin43基因转染后移植细胞connexin43表达增强,从而有助于BMSCs与宿主心肌细胞的整合或融合,并可能改善宿主心肌细胞间电机械耦联。
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