miRNA特异性抑制RhoC基因表达对卵巢癌细胞作用的研究

论文摘要

微小RNA是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA,短发夹状miRNA可在细胞内直接转化为siRNA,通过序列特异性抑制或针对mRNA降解来调控基因表达,从而参与细胞发育、增殖及凋亡等一系列重要生物学进程。本研究应用RNAi技术沉默RhoC基因观察其抗肿瘤作用,探讨特异性抑制RhoC基因表达对卵巢癌细胞作用的影响。针对RhoC的mRNA序列设计合成编码miRNA的DNA模板,经过鉴定、测序证明并成功的构建了pcDNATM6.2-GW/EmGFP-RhoC-miRNA真核表达载体（以后简称RhoC-miRNA）,并转染人卵巢癌SKOV3细胞,转染RhoC-miRNA重组质粒后能特异地降解细胞内RhoC基因转录的mRNA,从而抑制RhoC蛋白表达;细胞计数统计结果显示,特异性干扰组活细胞的增殖速率明显低于非特异性干扰组、空白对照组;采用划痕法检测细胞趋向运动能力,利用细胞穿越Matrigel基质实验检测细胞侵袭能力结果示:RhoC-miRNA载体有效地特异性地抑制SKOV3细胞增殖、趋向运动能力及侵袭能力,其机制为下调了卵巢癌细胞中MMP2蛋白表达。关闭RhoC基因后,SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性显著提高,与单独使用紫杉醇相比,RhoC-miRNA重组质粒联合紫杉醇组中促进凋亡的基因Caspase-3明显增高,而抗凋亡蛋白Suvivin mRNA水平显著降低。本实验成功构建了RhoC基因的干扰基因miRNA真核表达载体pcDNATM6.2- GW/EmGFP-RhoC-miRNA,可以在人卵巢癌细胞内长期“敲弱”（knock down）RhoC基因,通过抑制RhoC基因下游的细胞调控系统,抑制SKOV3细胞增殖、趋向运动能力及侵袭能力,间接恢复卵巢癌细胞对化疗的敏感性。这将为揭示卵巢癌转移的分子机制奠定基础,也将为卵巢癌的基因治疗开辟一条崭新的途径。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 Rho 亚家族蛋白在恶性肿瘤发生发展中的作用
• 第二章 RNAi 技术及其在卵巢癌基因治疗中的作用
• 第二篇 实验研究
• 第一章 RhoC-miRNA 真核表达载体的构建、鉴定及对 RhoC 基因表达的干扰作用的研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.1.2.1 RhoC-miRNA 重组质粒的构建
• 1.1.2.2 RhoC 发卡miRNA 模板寡核苷酸退火
• 1.1.2.3 载体与目的片断的连接
• 1.1.2.4 扩增重组质粒并进行PCR 鉴定及测序
• 1.1.2.5 重组质粒纯化
• 1.1.2.6 细胞培养
• 1.1.2.7 用脂质体法转染发卡miRNA 表达载体
• 1.2 结果
• TM6.2-GW/Em GFP-miR 载体图'>1.2.1 pcDNA^TM6.2-GW/Em GFP-miR 载体图
• 1.2.2 单链DNA oligo 退火形成双链电泳结果
• 1.2.3 重组质粒电泳结果
• 1.2.4 重组质粒PCR 鉴定电泳结果
• 1.2.5 重组质粒测序结果
• 1.2.6 重组质粒质量与纯度测定结果
• TM6.2-GW/EmGFP- RhoC-miRNA 在SKOV₃ 细胞表达结果'>1.2.7 间接免疫荧光检测重组质粒 pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP- RhoC-miRNA 在SKOV₃细胞表达结果
• 1.2.8 激光共聚焦检测重组质粒转染的卵巢癌细胞的形态学变化（Fig.1.10,1.11 ,1.12）
• 1.2.9 RhoC 的mRNA 在稳定转染细胞中表达的RT-PCR 检测结果
• 1.2.10 Western-blot 法检测细胞内RhoC 蛋白的表达结果
• 1.3 讨论
• 第二章 miRNA 抑制基因RhoC 对卵巢癌细胞生物学功能影响的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 统计学处理
• 2.2 结果
• 3 细胞增殖能力的影响'>2.2.1 RhoC-miRNA 基因对SKOV₃细胞增殖能力的影响
• 2.2.2 划痕法检测细胞趋向运动能力
• 2.2.3 细胞穿越Matrigel 基质实验检测细胞侵袭能力结果
• 3凋亡的影响'>第三章 靶向RhoC 基因RNA 干扰技术联合紫杉醇对上皮性卵巢癌细胞SKOV₃凋亡的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 统计学处理
• 3.2 结果
• 3 细胞对紫杉醇化疗敏感性的影响'>3.2.1 RhoC-miRNA 转染的卵巢癌SKOV₃细胞对紫杉醇化疗敏感性的影响
• 3.2.2 流式细胞仪检测基因转染联合紫杉醇处理后细胞凋亡率
• 3 细胞中的凋亡基因Caspase－3、Survivin mRNA 的表达'>3.2.3 RT－PCR 法检测SKOV₃ 细胞中的凋亡基因Caspase－3、Survivin mRNA 的表达
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文和科研成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract