论文摘要
本研究以提高乳中IgG含量为主线,以乳中IgG生成和转运调控机理为研究目的,通过六个试验系统研究了影响IgG含量及转运的因素、转运受体基因多态性对IgG含量和转运的影响、免疫刺激后奶牛乳中IgG消长规律及转运变化、免疫刺激后基因表达变化等转运机理。试验一以单因素方差分析、多元相关分析、通径分析和典型相关分析研究了影响乳中IgG浓度及转运总量的影响因素。单因素方差分析和多元相关分析方法表明乳中IgG浓度与奶牛胎次（r = 0.378,P < 0.01）、泌乳天数（r = -0.145,P < 0.05）、乳糖（r = -0.223,P < 0.01）和体细胞分数SCS（r = 0.217,P < 0.01）相关显著;通径分析表明胎次对乳中IgG浓度的通径系数为Py1,x1 =0.31（P < 0.01）,为影响乳中IgG浓度的直接因素,而乳糖、产奶阶段和SCS的通径系数分别为Py1,x6 =-0.12、Py1, x2 =-0.11和Py1, x8=0.11,但均不显著（P > 0.05）表明这些因素为直接作用和间接作用综合作用的结果。典型相关分析结果表明,胎次、产奶阶段、乳成分等8项指标与免疫活性蛋白浓度之间存在4对典型变量,第一对和第二对典型变量分别包含了数据信息的67.3%和24.3%,具有统计意义。通径分析、典型分析可以刻画约IgG变异信息的30%、IgA 10%、IgM 20%、Lf 60%,说明本研究所涉及因素不能充分刻画乳中Ig浓度所有的变异,还有许多未知因素尚未涉及。本研究首次提出Lf指数（Lactoferrin Index）和IgG指数（Immunoglobulin G Index）,根据指数大小,可以预测乳中Lf和IgG浓度的高低。通过筛选,乳中Lf和IgG的含量分别提高了40.7%和19.5%,筛选效果显著。试验二进行了奶牛FcRn受体α链FCGRT基因和β链B2M基因SNP多态性与乳中IgG浓度及转运的相关研究,结果表明,FCGRT基因启动区存在4个SNP,分为6个单倍型,共有11种单倍型组合,但单倍型组合对牛奶IgG含量和牛奶IgG转运总量的效应均不显著（P>0.05）。在B2M基因外显子上存在3个SNP位点,分为4个单倍型,共有8种单倍型组合,单倍型组合对牛奶IgG含量和牛奶IgG转运总量的效应显著（P < 0.05）,对血清IgG含量和牛奶血液IgG浓度比值没有显著影响。单倍型组合H3H3奶牛个体为双碱基缺失纯合的奶牛个体,其奶牛个体有较低的乳IgG浓度和较高的血清IgG浓度（P < 0.05）,表明双碱基缺失纯合个体的乳腺转运IgG效率较低。通径分析表明添加B2M单倍型组合因素后,刻画IgG变异信息提高到40%.试验三以Lipase为抗原模型,成功的制备了免疫刺激复合物（ISCOM）疫苗,ISCOM微粒为典型的笼格状微粒,形态均一,大小平均为27.0nm,为二十面体结构。试验四在ISCOM疫苗制备的基础上,引进奶牛乳腺埋植技术和抗原缓释技术制备抗原缓释剂（ARD）,通过对奶牛乳腺埋植3种ARD,分别在埋植后0d、14d和28d刺激奶牛产生特异性抗体进入乳中。研究表明,乳腺埋植ARD对奶牛生产性能和乳成分没有影响,不会引发奶牛乳房炎;埋植后奶牛外周血液白细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数量增多,试验组T淋巴细胞SI指数在15d时显著增高（P<0.05）,表明ARD具有细胞免疫刺激作用,使奶牛的细胞免疫得到一定提高。奶牛血清中特异性抗体滴定效价均明显升高,ELISA滴定效价平均为2×106;埋植后9d便可检测到乳清中特异性抗体,其应答规律与3种ARD的释放一致。通过比较血清和乳清中特异性抗体含量变化,发现在血清效价相同的情况下,奶牛个体对IgG的转运存在差异;ARD埋植免疫后11d和20d抗体转运出现短暂性上升。试验五比较了初乳、常乳和免疫乳中特异性IgG效价,结果表明,ARD免疫后乳中ELISA效价平均为4.1×104,可以达到23d初乳的水平。试验六以泌乳小鼠为模型研究ISCOM免疫刺激后FCGRT和B2M基因mRNA表达情况,结果表明,小鼠乳腺B2M和FCGRT基因随着泌乳天数的上升而下降,B2M基因在0d表达最高,FCGRT基因在1d表达最高,此后维持在一个稳定水平;免疫荧光结果表明,0d的乳腺上皮细胞膜上的FcRn受体表达量要高于其它时间点。ISCOM的免疫刺激后,小鼠乳腺FCGRT和B2M基因mRNA表达上调,免疫后4d的FCGRT和B2M基因表达量要高于免疫后8d的表达量。
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摘要ABSTRACT第一章 绪论1 研究目的和意义2 国内外研究进展2.1 牛奶免疫活性蛋白功能及提高技术研究进展2.2 免疫乳生产最新研究进展2.3 奶牛乳腺Ig合成与分泌机理2.4 免疫球蛋白转运受体研究进展3 研究内容和技术路线3.1 研究内容3.2 技术路线第二章 中国荷斯坦奶牛泌乳期乳中免疫活性蛋白含量影响因素1 研究内容与技术路线1.1 研究内容1.2 技术路线2 材料与方法2.1 试验奶牛的选择及样品的采集2.2 乳成分及体细胞数的测定2.3 夹心ELISA测定Ig和Lf的含量2.4 IgG/Lf高合成能力奶牛筛选软件开发及奶牛筛选试验2.5 统计分析3 结果与分析3.1 单因素方差分析：乳中IgG含量的影响因素3.2 多元相关分析及通径分析：影响乳中IgG含量的直接因素和间接因素3.3 典型相关分析3.4 IgG/Lf高合成能力奶牛筛选试验效果4 讨论4.1 影响乳中IgG浓度的因素4.2 影响乳中Lf浓度的因素4.3 乳中Ig和Lf浓度与DHI数据之间的典型相关分析及其应用4.4 本研究所涉及的因素未能足够刻画乳中Ig的变异信息5 本章结论第三章 中国荷斯坦奶牛FcRn受体α链FCGRT基因和β链82M基因SNP多态性与乳中IgG含量及转运的相关性研究1 研究内容与技术路线1.1 研究内容1.2 技术路线2 材料与方法2.1 试验奶牛的选择及样品的采集2.2 夹心ELISA测定血液及乳中IgG含量2.3 样品DNA的提取2.4 PCR扩增、产物测序及SNP位点的确定2.5 FCGRT基因利用SNP Stream进行基因分型2.6 82M基因利用直接测序法进行基因分型2.7 统计分析3 结果与分析3.1 DNA提取效果及PCR扩增结果3.2 PCR产物测序分析发现SNP位点3.3 FCGRT基因多态性分析及其与乳中IgG含量及转运的相关3.4 B2M基因多态性分析及其与乳中IgG含量及转运的相关4 讨论5 本章结论第四章 免疫刺激复合物（ISCOM）疫苗制作及对小鼠免疫功能的影响1 研究内容与技术路线1.1 研究内容1.2 技术路线2 材料与方法2.1 抗原模型2.2 ISCOM疫苗制作2.3 ISCOM疫苗免疫效果2.4 数据统计3 结果与分析3.1 ISCOM疫苗电镜观察结果3.2 ISCOM疫苗体内毒性试验及安全剂量3.3 ISCOM疫苗对小鼠血清特异性抗体效价的影响4 讨论4.1 ISCOM微粒的制备4.2 Quil A是ISCOM疫苗安全性的限制因素4.3 ISCOM对小鼠体液免疫的影响5 本章结论第五章 奶牛埋植抗原缓释剂（ARD）后乳中IgG含量及转运变化1 研究内容与技术路线1.1 研究内容1.2 技术路线2 材料与方法2.1 第一期试验2.2 第二期试验2.3 数据统计3 结果与分析3.1 第一期试验3.2 第二期试验4 讨论4.1 ARD埋植是一种新型的免疫乳生产方法4.2 ARD生产免疫乳与其他方法的比较4.3 抗体的乳腺转运在奶牛个体间存在较大差异4.4 ARD埋植免疫后抗体转运出现短暂性上调5 本章结论第六章 初乳、常乳和免疫乳中的IgG含量的变化规律及比较1 研究内容与技术路线1.1 研究内容1.2 技术路线2 材料与方法2.1 免疫后乳样品的采集2.2 初乳和常乳样品采集2.3 乳清和血清特异性抗体滴度的测定2.4 乳清和血清中总IgG含量的测定2.5 SDS-PAGE电泳及相对定量分析2.6 统计分析3 结果与分析3.1 初乳中特异性IgG的变化规律及与免疫乳的比较3.2 初乳、常乳中总Ig含量的变化规律及与免疫乳的比较3.3 SDS-PAGE电泳及其相对定量分析4 讨论4.1 初乳中免疫球蛋白含量的变化规律及其与免疫乳的比较4.2 SDS-PAGE电泳及乳清中主要蛋白的相对定量分析5 本章结论第七章 小鼠ISCOM免疫刺激对乳腺IgG转运及FcRn受体表达的影响1 研究内容与技术路线1.1 研究内容1.2 技术路线2 材料与方法2.1 ISCOM疫苗制作2.2 泌乳小鼠的准备、免疫及样品采集2.3 小鼠免疫细胞、细胞因子及IgG的测定2.4 Real Time-PCR测定小鼠乳腺FcRn基因mRNA表达2.5 免疫荧光测定乳腺FcRn在细胞膜的表达2.6 数据统计分析3 结果与分析3.1 ISCOM免疫对小鼠细胞免疫功能的影响3.2 ISCOM免疫对小鼠体液免疫功能的影响3.3 ISCOM免疫对小鼠乳腺FCGRT和82M基因mRNA表达量的影响3.4 ISCOM免疫对小鼠乳腺FcRn受体在细胞膜上表达的影响4 讨论4.1 ISCOM疫苗对小鼠体液及细胞免疫的影响4.2 ISCOM疫苗对小鼠IgG转运的影响4.3 ISCOM疫苗对受体表达的影响5 本章结论第八章 总体结论1 论文总体结论2 本研究创新点3 有待进一步研究的问题参考文献附录附录一 ELISA测定乳中总Ig含量和特异性抗体效价附录二 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所《IgG/Lf高合成能力奶牛筛选系统V1.0》程序设计和解决方案附录三 12 重SNPstream基因分型系统操作方法附录四 本研究登录Genebank的SNP序列附录五 SDS-PAGE电泳及Quantity One定量分析致谢个人简历
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