一株假单胞菌低温脂肪酶基因的克隆及表达

论文摘要

从昆明理工大学生物工程技术研究中心冷库分离筛选到1株低温脂肪酶产生菌株,根据形态学和16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为假单胞菌属,并命名为Pseudomonas sp. PF16,简称PF16。PF16所产脂肪酶为胞内酶,该酶能水解橄榄油,在0℃仍显示有酶活,证明该酶为低温脂肪酶。PF16菌株在25℃发酵24 h后,经离心、收集菌体、超声波破碎、超滤、盐析等过程,获得粗酶液Lip-PF16。对其进行了温度稳定及pH稳定性研究。实验结果表明,Lip-PF16在0-25℃、pH 7.5-10范围内稳定,属于碱性低温脂肪酶。该酶具有良好的低温催化活性,在食品、洗涤、低温环境修复等工业上有着巨大的应用潜力。但该原始菌株产酶量低,培养周期长,不利于后续的研究与开发,必须克隆该脂肪酶基因进行高效表达。因此,本研究采用了两种克隆的策略：一是通过构建基因文库的方法来筛选脂肪酶基因；二是利用PCR克隆拼接的方法即运用BLASTp程（?）ClustalX序列分析软件进行序列比对分析,通过比对假单胞菌属的脂肪酶基因,找到它们的保守区域,然后根据保守序列设计简并引物分段扩增潜在的脂肪酶基因,最后通过拼接获得脂肪酶的全基因序列。实验表明,通过构建基因文库的方法较难筛选到脂肪酶基因,而利用PCR克隆拼接法能有效扩增出了脂肪酶全基因。该基因由1431bp碱基组成,编码476个氨基酸,预计分子量为50,230,理论等电点为4.58。氨基酸序列分析表明,lip-PF16属于家族I.3成员,与低温脂肪酶（ABI94371）有88%的相似性,与Pseudomonassp.MIS 38的低温脂肪酶有79%的相似性,进一步证明了该酶为低温脂肪酶。在此基础上,利用基因重组技术构建了表达载体lip-PF16/pET21a,将lip-PF16基因在大肠杆菌中进行了表达。实验结果表明,lip-PF16基因在大肠杆菌中得到了高效表达。通过SDS-PAGE检测,发现表达的蛋白质大多是以包涵体的形式存在,可溶性的不多。但少量的可溶性脂肪酶,既使在低温下也显示出了较高酶活。本研究以产碱性低温脂肪酶菌株Pseudomonas sp. PF16为实验材料,运用分子生物学技术获得了一个碱性脂肪酶基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,本研究为进一步对该碱性脂肪酶的研究与开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 脂肪酶研究进展
• 1.1.1 脂肪酶简介
• 1.1.2 脂肪酶的分类
• 1.1.3 脂肪酶的结构
• 1.1.4 脂肪酶分子生物学研究
• 1.1.5 脂肪酶的应用
• 1.2 低微生物的研究状况
• 1.2.1 低温微生物简介
• 1.2.2 低温微生物的生态分布及应用前景
• 1.2.3 冷适应微生物的冷适应机制—合成低温催化活性的低温酶（Cold-adapted enzyme）
• 1.3 低微脂肪酶的研究状况
• 1.3.1 低温脂肪酶简介
• 1.3.2 低温脂肪酶的生理生化特征
• 1.3.3 低温脂肪酶的结构特征
• 1.3.4 低温脂肪酶的研究方法及热点
• 1.3.5 低温脂肪酶的应用前景
• 1.4 立题依据
• 1.4.1 脂肪酶是重要的理论研究用酶
• 1.4.2 脂肪酶是重要的工业用酶
• 1.4.3 研究低温脂肪酶的意义
• 第二章 产低温脂肪酶细菌的分离、鉴定及部分酶学性质研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 产低温脂肪酶菌株的分离
• 2.2.2 PF16的形态学观察
• 2.2.3 酶的初步分离纯化
• 2.2.4 对硝基苯酚（p-Nitrophenyl）微摩尔消光系数的测定
• 2.2.5 酶活检测
• 2.2.6 蛋白含量测定
• 2.2.7 部分酶学性质研究
• 2.2.8 菌落PCR扩增分离菌株的16S rRNA基因序列
• 2.2.9 DNA序列测定
• 2.2.10 系统发育分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 产低温脂肪酶菌株的分离
• 2.3.2 菌株的形态学观察
• 2.3.3 对硝基苯酚（p-Nitrophenyl）微摩尔消光系数
• 2.3.4 考马斯亮蓝标准曲线的绘制
• 2.3.5 粗酶液酶活检测结果
• 2.3.6 酶的热稳定性
• 2.3.7 pH值稳定性
• 2.3.8 分离菌株的16S rRNA序列及比对结果
• 2.3.9 系统发育分析结果
• 2.4 讨论
• 第三章 Pseudomona sp.PF16基因文库的构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂及药品
• 3.2 方法
• 3.2.1 克隆假单胞菌PF16菌株的低温脂肪酶基因的技术路线
• 3.2.2 基因文库的构建
• 3.2.3 筛选脂肪酶基因
• 3.3 结果
• 3.3.1 PF16菌株基因文库的构建
• 3.3.2 脂肪酶基因的筛选
• 3.4 讨论
• 第四章 Pseudomona sp.PF16脂肪酶基因的克隆
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种与质粒
• 4.1.2 试剂及药品
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 序列比对及引物合成
• 4.2.2 脂肪酶基因片段的扩增
• 4.3 结果
• 4.3.1 PCR扩增结果
• 4.3.2 Pseudomonas sp.PF16的脂肪酶基因序列
• 4.4 讨论
• 第五章 低温脂肪酶Lip-PF16的异源表达
• 5.1 材料
• 5.1.1 细菌和质粒
• 5.1.2 培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 引物的合成
• 5.2.2 引物稀释
• 5.2.3 PCR扩增目的片段
• 5.2.4 PCR产物的纯化即胶回收
• 5.2.5 感受态细胞的制作
• 5.2.6 表达载体的构建
• 5.2.7 目的蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
• 5.2.8 SDS-PAGE检测
• 5.2.9 脂肪酶的酶活检测
• 5.3 结果
• 5.3.1 Lip-PF16/pET21a表达载体构建路线
• 5.3.2 PCR扩增低温脂肪酶基因
• 5.3.3 菌落PCR鉴定Lip-PF16/pMD18-T/DH5a
• 5.3.4 重组质粒Lip-PF16/pMD18-T的酶切鉴定
• 5.3.5 脂肪酶基因序列的测序确认
• 5.3.6 菌落PCR鉴定Lip-PF16/pET21a/DH5a
• 5.3.7 重组质粒Lip-PF16/pET21a的酶切鉴定
• 5.3.8 重组脂肪酶基因诱导表达后的SDS-PAGE检测
• 5.3.9 酶活检测结果
• 5.4 讨论
• 第六章 总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录
• 附录B 实验药品与设备